Este protocolo de alto rendimento permite a triagem rápida de mudas de tomate desde adesões selvagens ao patógeno bacteriano Pseudomonas seringae. O ensaio de inundação de mudas minimiza o tempo de crescimento das plantas e as necessidades da câmara de crescimento, permite uma rápida rotatividade das plantas e permite que grandes tamanhos de amostra sejam testados. Este ensaio é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para testar resistência em adesões selvagens e outras linhas com formações genéticas complexas.
O protocolo fornece instruções específicas para a innoculação de inundação de duas cepas de seringa Pseudomonas. No entanto, é versátil e pode ser modificado para detectar resistência do hospedeiro a outros patógenos bacterianos. Demonstrando o procedimento será Yana Hasan, especialista em pesquisa no meu laboratório.
Comece cultivando as mudas de tomate. Coloque as sementes de tomate em um tubo de microcentrífuga de 2,2 mililitros e adicione dois mililitros de solução de alvejante de 50%. Balance o tubo por 25 minutos e remova a solução de alvejante com uma pipeta.
Adicione dois mililitros de água ultra pura e lave as sementes invertendo o tubo cinco vezes. Aspire o líquido do tubo e repita a lavagem mais quatro vezes. Após a lavagem final, adicione dois mililitros de água ultra-pura e despeje as sementes em uma placa de Petri estéril.
Esterilizar fórceps batendo-os em etanol e depois usá-los para transferir cinco a sete sementes para uma placa de 100 por 25 mililitros com 0,5 XMS mais 0,8% de mídia ágar. Sele as bordas da placa com fita cirúrgica. Certifique-se de que as placas estão empilhadas e de frente para cima.
Estratifique as sementes esterilizadas a quatro graus Celsius no escuro por pelo menos três dias para sincronizar a germinação. Após três dias, oriente verticalmente as placas para que as raízes cresçam ao longo da superfície da placa e a linha de sementes seja orientada horizontalmente. Transfira as sementes para uma câmara de crescimento a 22 graus Celsius com um ciclo escuro de 16 horas e 8 horas.
Cresça as mudas por dez dias na câmara, momento em que elas normalmente exibirão totalmente emergidas e cotilledons expandidos e primeiras folhas verdadeiras emergentes. Listrar bactérias frescas em ágar KB apropriado com um palito de dente plano e estéril. Para PstT1, incubar a placa a 28 graus Celsius durante 48 horas antes de usar as bactérias no experimento de inundação.
Para preparar o inóculo, resususpense as bactérias em cloreto de magnésio estéril e dez milimônios a uma densidade óptica de 0,1. Em seguida, faça duas diluições seriais para obter uma concentração de trabalho com um OD600 de 0075. Também prepare uma diluição de um a dez copolímero surfactante organosilicone não iônico em dez cloreto de magnésio milililar.
Vórtice e adicione-o às bactérias, girando o tubo para misturar. Transfira as placas com as mudas de dez dias de idade da câmara de crescimento para o armário de biossegurança e remova a fita cirúrgica. Em seguida, transfira seis mililitros de inóculo para cada placa.
Empurre suavemente as mudas para o inóculo com uma ponta de pipeta e inicie um temporizador por três minutos. Segure uma placa em cada mão e incline a frente da placa para baixo para submergir os cotilledons e folhas das mudas. Swish o inóculo lado a lado cinco a sete vezes, em seguida, ponta as placas de volta para cobrir as raízes com o inóculo.
Incline as placas para baixo novamente e repita o ciclo por um total de três minutos. Despeje o inóculo das placas, coloque-os em uma superfície plana e despeje qualquer inóculo residual pela segunda vez. Enrole as placas e coloque-as de volta na câmara de crescimento.
As cultivares Moneymaker-PtoR e Moneymaker-PtoS foram inundadas com PSTDC3000 e fenotítipadas de sete a dez dias após inundações. As mudas moneymaker-PtoR carregam o aglomerado genético PtoPRF e foram resistentes ao PSTDC3000. Enquanto as mudas de Moneymaker-PtoS quase isogênicas, que não podem reconhecer os efeitos PSTDC3000 AVRPto ou AVRPto-B, morreram rapidamente, dentro de sete dias após inundações.
Mudas de dez dias foram inundadas com PstT1 e fenotítipadas pelo menos dez dias após inundações. Adesões suscetíveis estavam mortas, tinham meristems atópicos marrons e não tinham novo crescimento. Em contraste, as mudas resistentes apresentaram um alto nível de crescimento verde e sobreviveram à infecção com PstT1.
Ensaios de crescimento bacteriano foram realizados para confirmar quantitativamente a resistência ao PstT1 e ao Solanum NeoRici LA1329. Houve uma diferença de 1,7 log no crescimento bacteriano entre la1329 resistente e suscetível e uma diferença de 1,6 log entre la1329 resistente e Moneymaker-PtoS, que se correlacionava com os resultados fenotípicos. Ao realizar este ensaio, as coisas mais importantes a se lembrar são prestar muita atenção à técnica asséptica em todo o protocolo e garantir que todas as mudas na placa estejam completamente inundadas.
Certifique-se de autoclave tecido vegetal infectado e bactérias e descarte de materiais de acordo com as normas apropriadas.
