Questo protocollo ad alta produttività consente un rapido screening delle piantine di pomodoro dalle adesioni selvatiche all'agente patogeno batterico Pseudomonas syringae. Il test di alluvione delle piantine riduce al minimo i tempi di crescita delle piante e le esigenze della camera di crescita, consente un rapido turnover delle piante e consente di testare campioni di grandi dimensioni. Questo saggio è un potente strumento che può essere utilizzato per migliorare la resistenza nelle adesioni selvagge e in altre linee con background genetici complessi.
Il protocollo fornisce indicazioni specifiche per l'innocuazione delle inondazioni di due ceppi pseudomonas siringae. Tuttavia, è versatile e può essere modificato per rilevare la resistenza dell'ospite ad altri agenti patogeni batterici. A dimostrare la procedura sarà Yana Hasan, specialista di ricerca nel mio laboratorio.
Inizia coltivando le piantine di pomodoro. Posizionare i semi di pomodoro in un tubo di microcentrifugo da 2,2 millilitri e aggiungere due millilitri di soluzione di candeggina al 50%. Scuotere il tubo per 25 minuti, quindi rimuovere la soluzione di candeggina con una pipetta.
Aggiungere due millilitri di acqua ultra pura e lavare i semi invertendo il tubo cinque volte. Aspirare il liquido dal tubo e ripetere il lavaggio altre quattro volte. Dopo il lavaggio finale, aggiungere due millilitri di acqua ultra pura e versare i semi in una piastra di Petri sterile.
Sterilizzare le forcep fenicotteri in etanolo, quindi usarle per trasferire da cinque a sette semi su una piastra da 100 per 25 millilitri con 0,5 XMS più 0,8% di supporto di agar. Sigillare i bordi della piastra con nastro chirurgico. Assicurarsi che le piastre siano impilate piatte e a faccia in su.
Stratificare i semi sterilizzati a quattro gradi Celsius al buio per almeno tre giorni per sincronizzare la germinazione. Dopo tre giorni, orientare verticalmente le piastre in modo che le radici crescano lungo la superficie del piatto e la linea dei semi sia orientata orizzontalmente. Trasferire i semi in una camera di crescita impostata su 22 gradi Celsius con un ciclo scuro di 16 ore di luce e 8 ore.
Far crescere le piantine per dieci giorni nella camera, a quel punto in genere esicheranno cotyledon completamente emersi ed espansi e prime foglie vere emergenti. Striati batteri freschi sull'agar KB appropriato con uno stuzzicadenti piatto e sterile. Per PstT1, incubare la piastra a 28 gradi Celsius per 48 ore prima di utilizzare i batteri nell'esperimento di alluvione.
Per preparare l'inoculo, resopend aseticamente i batteri in sterile, dieci cloruri di magnesio millimolare ad una densità ottica di 0,1. Quindi effettuare due diluizioni seriali per ottenere una concentrazione di lavoro con un OD600 di 0075. Preparare anche una diluizione da uno a dieci di un copolimero ten millimolare di ten millimolare di tensioattivi.
Vortice e aggiungerlo ai batteri, girando il tubo per mescolare. Trasferire le piastre con le piantine vecchie di dieci giorni dalla camera di crescita all'armadio di biosicurezza e rimuovere il nastro chirurgico. Quindi trasferire sei millilitri di inoculo su ogni piastra.
Spingere delicatamente le piantine nell'inoculo con una punta di pipetta e avviare un timer per tre minuti. Tenere una piastra in ogni mano e inclinare la parte anteriore del piatto verso il basso per immergere i cotyledon e le foglie delle piantine. Ruotare l'inoculo da un lato all'altro da cinque a sette volte, quindi ribaltare le piastre per coprire le radici con l'inoculo.
Inclinare nuovamente le piastre verso il basso e ripetere il ciclo per un totale di tre minuti. Versare l'inoculo dalle piastre, impostarle su una superficie piana e versare per la seconda volta qualsiasi inoculo residuo. Avvolgere di nuovo i piatti e rimetterli nella camera di crescita.
Le cultivar Moneymaker-PtoR e Moneymaker-PtoS sono state inondate di PSTDC3000 e fenotipate da sette a dieci giorni dopo le inondazioni. Le piantine Moneymaker-PtoR trasportano l'ammasso genico PtoPRF ed erano resistenti al PSTDC3000. Mentre le piantine Moneymaker-PtoS quasi isogeniche, che non sono in grado di riconoscere gli effettori PSTDC3000, AVRPto o AVRPto-B sono morte rapidamente, entro sette giorni dall'alluvione.
Piantine vecchie di dieci giorni sono state inondate di PstT1 e fenotipate almeno dieci giorni dopo le inondazioni. Le adesioni sensibili erano morte, avevano meristemi apicale marroni e mancavano di nuova crescita. Al contrario, le piantine resistenti mostrava un alto livello di nuova crescita verde e sopravvissero all'infezione da PstT1.
I test di crescita batterica sono stati eseguiti per confermare quantitativamente la resistenza PstT1 e Solanum NeoRici LA1329. C'era una differenza di log 1.7 nella crescita batterica tra LA1329 resistente e suscettibile e una differenza di log 1.6 tra la1329 resistente e Moneymaker-PtoS, che era correlata con i risultati fenotipiche. Quando si esegue questo saggio, le cose più importanti da ricordare sono prestare molta attenzione alla tecnica asettica in tutto il protocollo e assicurarsi che tutte le piantine sul piatto siano completamente allagate.
Assicurarsi di autoclave infetti tessuto vegetale e batteri e smaltire i materiali in conformità con le normative appropriate.
