Protokolümüz, monositler, makrofajlar ve T-hücrelerinin ve bunların nöronlar, ovyum ve bağışıklık sisteminin çeşitli diğer dokularındaki ilgili alt kümelerinin ayrıntılı olarak tanımlanmasını ve analizini sağlar. Tekniğimiz osteoartritik immün yanıtın kapsamlı bir karakterizasyonu için sinovyum ve diğer ilgili dokulardan yaşam bağışıklık hücrelerinin güvenilir hasat kolaylaştırır. Bir osteoartrit modeli fare ilgi dokuların izolasyon için, bir supine pozisyonda fare ile, göğüs silin, karın ve bacaklar 70% etanol ile.
Karın boşluğu bozulmadan bırakarak dikkatle karın orta hattı boyunca deri açmak için makas kullanın. Ve yavaşça altta yatan kas uzak hayvanın sağ tarafında deri çekin, deri altı yağ dokusu deribağlı bırakarak. Fareyi bir kesme mikroskobunun altına yerleştirin ve uylukta bulunan yağ dokusunu hafifçe dışarı çıkarmak için iki kavisli ince çalgılar kullanın.
Üç çapraz damarları tanımladıktan sonra, kapsül rüptürü değil dikkat, damarların kesiştiği yerde bulunan inguinal lenf düğümü kaldırmak için ince diseksiyon forseps kullanın. Lenf düğümü yüzeyinden kalan yağ kaldırmak ve karın boşluğu açmak için forseps kullanın. Kalan yağ görülemezse, daha önce hazırlanmış ve rpmi medya 0.5 mililitre ile dolu altı iyi plaka etiketli hemen lenf düğümü yerleştirin.
Bundan sonra, karın boşluğu açın. Dalak çıkarmak ve hafifçe aort ve çatallanma ortaya çıkarmak için bağırsak ları ayıklamak için ince makas kullanın. Bundan sonra, daha önce hazırlanmış ve rpmi medya 0,5 mililitre dolu altı iyi oynanmış etiketli hemen dalak yerleştirin.
Abdominal aort ve ortak iliak arter kökenli terminal segmentinde bulunan iliak lenf düğümü çıkarın ve dikkatle her iki arka ekstremite deri kaldırmak. Hemen daha önce hazırlanmış ve etiketli altı iyi plaka iki hayvan tüm lenf düğümleri havuza RPMI medya 0,5 mililitre ile lenf düğümü yerleştirin. Ince makas veya neşter kullanarak bağlı kas dokusunun sol uyluk temiz ve dikkatle hem stifle ve kalça eklemi kesilir, femur kaldırırken tüm kemik bozulmadan bırakarak.
Daha sonra daha önce hazırlanmış ve rpmi medya 0,5 mililitre ile dolu altı kuyu plaka etiketli femur yerleştirilir. Sağ boğucu eklem patella tendonu belirleyin ve patella için quadriceps tendon proksimal yaklaşık beş mililitre maruz kalana kadar eklem bitişik kas dokusu proksimal kaldırmak için ince makas kullanın. Bir sap oluşturmak için patella yaklaşık üç ila dört milimetre proksimal quadriceps tendonu ile kesin ve hafifçe eklem kapsüle ek kenarları ortaya çıkarmak için eklem uzak gerginlik çekmek için ince forseps kullanın.
Uyluk kemiği ile başlayan ve tibia doğru hareket, dikkatle quadriceps tendonu üzerinde nazik bir çekiş korurken her iki tarafta eklem kapsülü kenarları boyunca kesmek için bir neşter kullanın. Sinovyal doku bloğu sadece tibia bağlı olduğunda, intraartiküler yağ yastığı patella açıkça görülebilen distal olmalı ve hafifçe Minsky eklem ve ön kısmından ayrılabilir. Daha sonra, sinovyal doku bloğu kaldırmak için eklem kapsülü kalan kısmı boyunca kesilmiş ve hemen önceden hazırlanmış ve rpmi medya 1.5 mililitre ile dolu altı iyi plaka etiketli yerleştirin.
Tüm dokular toplandığında, 15 mililitrelik bir tüpte 70 mikrometrelik hücreli süzgeç üzerine her koşul dalak başına iki havuzlu dalak yerleştirin ve steril üç mililitrelik şırınga pistonunu kullanarak süzgeçi sık sık 6 litrelik RPMI 1640 orta ve %10 FBS ile tamamlayarak sifonu temizleyen örgü filtreden dokuları yavaşça kütlehızında olarak derecelendirin. Hücreleri santrifüj le çökün ve beş mililitre kırmızı kan hücresi lisis kirpisinde peleti yeniden askıya alın. Beş dakika sonra, PBS 10 mililitre ile reaksiyonu durdurmak ve hücreleri santrifüj.
Daha fazla kırmızı kan hücresi gözlenmediğinde, sayım için bir mililitre taze PBS peleti yeniden askıya alın. Lenf düğümü işleme için yeni bir 15 mililitre tüp 70 mikrometre hücresüz üzerine dört lenf düğümleri yerleştirin ve tek bir hücre süspansiyon içine örgü ile lenf düğümleri yavaşça kızdırmak için yeni bir steril üç mililitre dalgıç kullanın, sonra beş dakika için 500 kez G hücreleri santrifüj, supernatant atın ve pbs sayma için 500 mikrolitre pelet yeniden askıya. Kemik iliğini izole etmek için, sağlam femurdikkatle kavramak için bir doku başparmak forceps kullanın ve proksimal femur çok ucunu kesmek için keskin makas kullanın.
Femur intercondylar çentik ortasına bir 23 gauge iğne yerleştirin ve çentik içine bir delik delmek için nazik basınç uygularken iğne döndürün. İğneyi gerektiği gibi değiştirerek, kemik içeriğini 15 mililitrelik yeni bir tüpte 70 mikrometrelik bir süzgeç üzerine %10 FBS ile tamamlayın ve kemik iliğini mesh'ten hafifçe bastırmak için yeni bir üç mililitrelik şırınga pistonu kullanın. Bundan sonra, dalak için gösterildiği gibi RBC adım ını gerçekleştirin.
Daha fazla kırmızı kan hücresi gözlenmediğinde, sayım için bir mililitre taze PBS peleti yeniden askıya alın. Sinovyal doku işleme için küçük parçalar halinde iki sinovyal doku blokları zar ve yeni bir 15 mililitrelik tüp içine örnekleri aktarmak için ince cerrahi makas kullanın. Kalan hücreleri ve sinovyal dokuları toplamak ve numune toplama tüpünde yıkamayı çekmek için toplama kabını 500 mikrolitre orta ile durulayın.
Daha sonra, mililitre son konsantrasyonbaşına bir birim elde etmek için yeterli miktarda enzim ekleyin ve bir rotator iki saat boyunca bir kuvözde 37 santigrat derece sinovyal doku örneği sindirmek. Tüpleri rotatora yerleştirirken yeterli hareketi sağlayın. Kuluçka sonunda, RPMI sekiz mililitre ile sindirimi durdurmak 10% FBS ile takviye ve yeni bir içine 70 mikrometre hücre süzgeçi ile hücre süspansiyon filtre.
Eski 15 mililitrelik tüpü beş mililitre orta ile durulayın ve filtreyi yıkamak için kullanın. Daha sonra, santrifüj ile hücreleri tortu ve sayma için PBS 500 mikrolitre pelet resuspend. İzole bağışıklık hücrelerinin canlılık boyama gerçekleştirmek için, iki farklı 96 iyi U-alt plakalar uygun kuyulara her hücre süspansiyon beş hücreye beş kez 10 ekleyin ve her kuyunun altına hücreleri toplamak.
Her zaman negatif kontroller olarak her doku tipinin yeterli lekesiz hücreleri içerir. Hücreleri 200 mikrolitre PBS ile yıkayın ve 100 mikrolitre hücredeki peletleri, ışıktan korunan dört santigrat derecede 15 dakikalık bir kuluçka için her kuyuda amin reaktif boyayla yeniden askıya alın. Kuluçka sonunda yıkama başına FACS tampon 200 mikrolitre hücreleri iki kez yıkayın ve ilgi veya kontrol kokteyluygun antikor 100 mikrolitre her pelet yeniden askıya.
Hem hücre içi hem de hücre dışı boyama aynı şekilde yapılırsa hücre dışı boyama adımını şimdi gerçekleştirin. Işıktan korunan 4 derece lik 30 dakikalık kuluçkadan sonra hücreleri 200 mikrolitre FACS tamponu ile iki kez yıkayın ve hücreleri ve monosit alt set panel plakasını 250 mikrolitre FACS tamponu bir milimolar EDTA ile tamamlayın. Bu adımı ancak hücre içi boyama planlanmamışsa uygulayın, aksi takdirde protokolün hücre içi boyama boyutuna geçin.
Ardından, her monosit alt kümesi örneğini ışıktan korunan buz üzerinde ilgili FACS tüpüne aktarın. T hücreli alt panel hücrelerinin hücreler arası boyanması için, ışıktan korunan 40 dakikalık bir kuluçka için uygun bir fiksasyon ve permeabilizasyon kitinden 200 mikrolitre sabitleme tamponundaki peletleri yeniden askıya alın. Kuluçka sonunda hücreleri 200 mikrolitre permeabilizasyon yıkama tamponu ile iki kez yıkayın ve peletleri 100 mikrolitrelik uygun ilgi antikorveya kontrol kokteylinde, ışıktan korunan 40 dakikalık bir kuluçka için yeniden askıya alın.
Daha sonra, permeabilizasyon 200 mikrolitre yıkama başına tampon yıkama hücreleri iki kez yıkayın. Ve 250 mikrolitre FACS artı EDTA tamponundaki hücreleri yeniden askıya alarak numuneleri ışıktan korunan buz üzerindeki ilgili FACS tüplerine aktarın. Burada, DMM tedavi edilen hayvanların kemik iliğinden toplanan bağışıklık hücreleri üzerindeki monosit alt kümesi paneli için hiyerarşik gating stratejisi gözlemlenebilir.
Lekesiz troller ölü canlı leke için gerçek negatifleri belirlemek için kullanılabilir ve kapılar deney gerektiği gibi yapılır her zaman ayarlanabilir. Bu temsili analizde, bağışıklık hücreleri sinovyal dokulardan izole edildi ve hücre dışı yüzey belirteçleri ile lekeli, Altı hafta Sonra DMM veya sahte kontrol cerrahisi. DMM tedavi edilen hayvanlarda, sahte cerrahi farelerde gözlenen hücre popülasyonlarına göre Ly-SC pozitif MHC2 negatif ve M2 makrofajlarının daha yüksek bir yüzdesi gözlenmektedir.
Burada, DMM tedavi edilen hayvanların dalak izole bağışıklık hücreleri üzerinde ekstra ve hücre içi T-hücre paneli için hiyerarşik gating stratejisi görülebilir. DMM hayvanlarının lenf düğümleri ve sinovyal dokularının yanı sıra daha yüksek sayıda T düzenleyici hücre ve TH17 hücrelerinde TH1 hücrelerinin daha yüksek bir yüzdesi gözlenmektedir. Yüksek kaliteli numunelerin elde edilmesini sağlamak için dokuların hızlı, titiz ve tutarlı bir şekilde hasat edilmesi gerekmektedir.
Bağışıklık hücreleri izole edildikten sonra, diğer downstream analizleri rtpcr, hücre kültürü ve kan üzerinde dinlenme gibi ilgi moleküler süreçleri bir ışık parlamaya yapılabilir.
