Usando la nostra tecnica, possiamo testare potenziali sostanze antiepilettiche all'interno di campioni cerebrali umani per aiutare nello sviluppo di farmaci per l'epilessia del lobo temporale. Il tessuto cerebrale umano ha il vantaggio di violare il limite trasmittezionale tra ricerca di base e applicazioni cliniche. Il giorno della procedura o il più tardi possibile il giorno prima, scongelare 50 millilitri di una soluzione aCSF colina 10x in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius e aggiungere la soluzione scongelata e 50 millilitri di soluzione 10x da due a circa 300 millilitri di acqua doppia distillata.
Aggiungere concentrazioni finali di glucosio e cloruro di calcio alla miscela e mescolare fino a quando non si scioglie. Quindi, aggiungere acqua a doppia distillazione a un volume finale di 500 millilitri. Misurare l'osmolarità.
E riempire una bottiglia con circa 100 millilitri della 1x colina aCSF. Il giorno della procedura, raffreddare la colina 1x aCSF sul ghiaccio e utilizzare un distributore di gas di vetro collegato al gas carbogeno per carbogenare la soluzione per almeno 10-15 minuti. Almeno 10-15 minuti prima della procedura, prewarm l'aCSF di stoccaggio, alto potassio più 4-amminopiridina aCSF e basso magnesio più bicucullina a 35 gradi Celsius con carbogenazione.
Per preparare la camera di interfaccia, tagliare due pezzi di carta filtrante quattro per due centimetri per ogni compartimento di tenuta delle fette e impilare i pezzi uno sopra l'altro. Quindi, posizionare sottili corde di cotone intorno ai pezzi di carta filtrante all'interno dei vani per rompere la tensione della soluzione e garantire un flusso uniforme. E posizionare da tre a quattro pezzi di carta filtrante da 1,5 per un centimetro sopra il pezzo più grande di carta da filtro in ogni compartimento.
Prima di acquisire le fette di tessuto, utilizzare il 70% di etanolo per pulire l'area di preparazione e posizionare una copertura sull'area. Posizionare super colla, due pinzette affilate, una spatola, un bisturi con lame e una lama per il taglio ruvido del tessuto cerebrale vicino al vibratomo. Pulire il vassoio tampone e la piastra del campione del vibratoma con il 70% di etanolo.
Quando il vassoio tampone è completamente asciutto, coprirlo con un foglio di alluminio e posizionare il vassoio nel bagno di ghiaccio. Riempire il bagno di ghiaccio con ghiaccio tritato e mantenere il bagno a meno 20 gradi Celsius fino alla preparazione. Quindi, pulire il vibratomo e la lama del rasoio con il 70% di etanolo e calibrare il vibratoma per ridurre al minimo eventuali vibrazioni verticali e danni ai tessuti durante la procedura di affezione.
Immediatamente dopo aver acquisito il campione di tessuto, rimuovere il tessuto dalla colina di trasporto aCSF e tagliare via eventuali porzioni bruciate di tessuto. Tagliare una superficie uniforme per facilitare l'incollaggio del pezzo di tessuto sulla piastra del campione e utilizzare il vibratoma per affettare il tessuto cerebrale in fette spesse 400 micrometri, regolando l'ampiezza e la velocità del vibratomo se necessario durante il taglio. Alcune parti dell'ippocampo umano possono essere più resistenti al taglio di altre.
Prestare particolare attenzione e tempo può migliorare notevolmente la qualità del campione. Utilizzare un bisturi per tagliare le fette cerebrali per adattarsi alla camera di registrazione e utilizzare una spatola e piccole forcep per posizionare con cura le fette sui piccoli pezzi di carta da filtro nella camera di interfaccia per almeno un'ora. Per la registrazione dell'attività epileptiforme, posizionare una membrana semipermeabile incollata a un anello di plastica nella camera e collegare i tubi di afflusso e deflusso della camera a una pompa peristaltica.
Riempire i tubi e la camera con aCSF carbogenato prerifatti. Per preparare gli elettrodi di registrazione, riempire le pipette di vetro da uno a due megaohm con soluzione di cloruro di sodio da 154 millimolare. Posizionare le pipette in un portaelettro e utilizzare una pinzetta e una spatola per trasferire una fetta ippocampale dalla camera di interfaccia in una piastra di Petri piena di aCSF carbogenato.
Rimuovere la carta da filtro senza capovolgere la fetta e posizionare la fetta nella camera di registrazione. Tenere la fetta in posizione con la rete a fette e posizionare gli elettrodi nella regione di interesse. Iniziare la registrazione.
L'attività di scoppio indotta dall'alto potassio più 4-amminopiridina dovrebbe essere visibile da due a cinque minuti dopo il lavaggio, mentre l'induzione di eventi simili a convulsioni da basso magnesio più bicucullina può richiedere fino a 30 minuti. L'applicazione di alto potassio più 4-amminopiridina induce attività epileptiforme sotto forma di eventi burst in pochi minuti. Eventi simili a crisi epilettiche con una durata di oltre 10 secondi possono essere indotti con l'applicazione di magnesio basso più bicucullina.
Il numero di eventi burst diminuisce sia durante l'applicazione della lacosamide che l'applicazione della dimetiletanolammina, sebbene le ampiezze non siano per lo più influenzate. La qualità del tessuto cerebrale può anche essere migliorata riducendo la contaminazione e i danni durante la preparazione. Le fette cerebrali umane preparate con i nostri metodi possono anche essere utilizzate per indagare le funzioni fisiologiche di base dei neuroni utilizzando patch clamp o indagare l'espressione genica utilizzando varie tecniche.
I laboratori di tutto il mondo hanno iniziato a studiare i meccanismi di base all'interno del cervello umano, e queste intuizioni possono essere utilizzate per aiutare nello sviluppo di farmaci e possono essere testate utilizzando i nostri metodi proposti.
