نقدم لأول مرة، نهجا جديدا لتوليد قابلة للاستنساخ وقابلة للتطوير، من خلايا IPS المستمدة من Organoids Cerebellar، والشروط الكيميائية المحددة، وذلك باستخدام المفاعلات الحيوية استخدام واحد. للحصول على خلايا لبذات المفاعل الحيوي، إضافة ملليلتر واحد من خلية مفرزة المتوسطة، إلى كل بئر من ستة آبار من iPSC الإنسان. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة سبع دقائق، حتى تهتز لطيف يفصل بسهولة الخلايا، من البئر.
باستخدام p 1000 micropipette، pipet الخلية مفرزة المتوسطة، صعودا وهبوطا، حتى الخلايا تتفكك في خلايا واحدة. أضف المقبل ملليلترين، من خلية كاملة ثقافة متوسطة لكل بئر، وهذا سوف تعطيل الهضم الأنزيمي. ثم استخدام ماصة، لنقل بلطف الخلايا إلى أنبوب مخروطي عقيم.
جهاز طرد مركزي الأنبوب في 210 مرة الجاذبية لمدة ثلاث دقائق. إزالة supernatant، وإعادة تعليق بيليه الخلية في المتوسطة الثقافة. عد الخلايا باستخدام قياس الهيموسيت، وصبغة زرقاء trypan.
انظر سفينة مفاعل حيوي مع iPSC، في كثافة 250،000 خلية لكل ملليلتر. أدخل وعاء مفاعل حيوي، في وحدة قاعدة عالمية، في حاضنة في 37 درجة مئوية، رطوبة 95٪ وثاني أكسيد الكربون 5٪. لتعزيز تجميع iPSC، قم بتعيين معدل الانفعالات لوحدة التحكم الأساسي إلى 27 دورة في الدقيقة.
في اليوم الأول، مع اليوم صفر يجري يوم بذر مفاعل حيوي، وضع مفاعل حيوي، ووحدة قاعدة في غطاء تدفق العقيمة، ثم استخدام ماصة المصلية، لجمع عينة ملليلتر واحد، من تعليق الخلية. لوحة تعليق الخلية في مرفق منخفضة جدا، 24 لوحة جيدا. استخدام المجهر، لتأكيد أن المجاميع المشتقة iPSC قد شكلت.
إذا كان الأمر كذلك، التقاط صور من المجاميع في 40 X أو 100 X.Continue زراعة iPSC وsbioreactor، حتى متوسط قطر المجاميع، هو 100 ميكرومتر، ثم استبدال 80٪ من المتوسطة، مع MT01 الطازجة دون المانع الصخور. عندما المجاميع، تصل إلى 200 إلى 250 متر ميكرو في القطر، والسماح لجميع organoids تسوية، في الجزء السفلي من مفاعل حيوي، ثم استبدال جميع المتوسط قضى، مع gfCDM التمايز المتوسطة. ضع وحدة القاعدة والمُعدّل الحيوي في الحاضنة و قلّد الهياج إلى 25 لفة في الدقيقة.
بعد إزالة ناظر من organoids المخزنة، إضافة ملليلتر واحد من 15٪ السكروز إلى بيليه، ويخلط جيدا عن طريق دوامة بلطف. بعد احتضان الأعضاء بين عشية وضحاها، عند أربع درجات مئوية، وإزالة محلول السكروز، ثم إضافة ملليلتر واحد من 15٪سكروز، 7.5٪الجيلاتين، ومزيج بسرعة عن طريق دوامة بلطف. في حين أن organoids هي احتضان في 37 درجة مئوية ملء حاوية بلاستيكية في منتصف الطريق مع 15٪ السكروز 7.5٪ حل الجيلاتين، والسماح لها لترسيخ.
بعد أن تم احتضان organoids لمدة ساعة واحدة، واستخدام ماصة باستور، لوضع قطرة من خليط الجيلاتين السكروز العضوي، على رأس السكروز الصلبة والجيلاتين. بعد انتظار 15 دقيقة للهبوط إلى ترسيخ، ملء ما تبقى من حاوية بلاستيكية، مع أكثر 15٪ السكروز، 7.5٪ الجيلاتين، والسماح لها لترسيخ تماما في درجة حرارة الغرفة ومن ثم احتضانه لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية. قطع الجيلاتين إلى مكعب، مع organoids في المركز، إصلاح المكعب إلى قطعة من الورق المقوى، مع قطرة من مركب أكتوبر، ثم وضعت 250 ملليلتر من إيسوبينتان، في كوب 500 ملليلتر، وملء حاوية مناسبة، مع النيتروجين السائل.
باستخدام ملقط وقفازات سميكة، ضع بعناية كوب من إيسوبنتان، على سطح النيتروجين السائل. ال Isopentane والنيتروجين السائل، هي الكواشف الخطرة. استخدام هذين الكواشف، تتطلب معدات الحماية الشخصية، بما في ذلك قفازات سميكة والتهوية الكافية.
عندما يبرد إيسوبنتان إلى درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية، ضع مكعب الجيلاتين في إيسوبنتان حتى يتجمد. مكعب مجمدة جيدا، وتنتج صوت معدني عندما استغلالها بخفة مع ملقط، مما يدل على أنه على استعداد ليتم تخزينها. غسل شرائح المجهر التي تحتوي على أقسام organoid، مع 50 ملليلتر 1X PBS لمدة خمس دقائق، ثم نقل الشرائح إلى جرة كوبلين، تحتوي على 1X PBS الطازجة.
نقل الشرائح إلى جرة كوبلين، تحتوي على 50 ملليلتر من الجليسين الطازجة وإعدادها واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم نقل الشرائح إلى جرة كوبلين، تحتوي على 50 ملليلتر من 0.1٪تريتون، و permeabilized لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح مرتين مع 1X PBS ، لمدة خمس دقائق في كل مرة. إعداد طبق مناعة، مع ورقة ثلاثة ملليمتر، غارقة في PBS 1X.
جفف الشرائح بمنديل حول الشرائح ووضعها على ورقة الـ 3 ملليمترات. مع ماصة باستور، وتغطي كل شريحة مع 0.5 ملليلتر من حظر الحل. بعد احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وإزالة محلول منع الزائدة ودفع الشرائح مع الأنسجة، في جميع أنحاء شرائح.
ضع 50 ميكروليترات من الأجسام المضادة الأولية المخففة ، على كل شريحة واغطيها بزلات الغطاء. الدانتيل الشرائح، في طبق المثبطة للمناعة أعدت سابقا، واحتضان لهم في أربع درجات مئوية. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، نقل الشرائح إلى جرة كوبلين، مع 50 ملليلتر من TBST، والسماح للزلات الغطاء تسقط، ثم غسل الشرائح ثلاث مرات مع TBST، لمدة خمس دقائق في كل مرة.
ضع 50 ميكروليتر، من الأجسام المضادة الثانوية المخففة على كل شريحة، واغطيها بزلات الغطاء. ضع الشرائح، في طبق المناعة المعدة مسبقًا، حضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ومحمية من الضوء. نقل الشرائح إلى جرة كوبلين مرة أخرى، وغسلها ثلاث مرات مع 50 ملليلتر من TBST، لمدة خمس دقائق في كل مرة.
باستخدام باستور Pipette، في 0.5 ملليلتر من محلول dappy، على سطح كل شريحة واحتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد 24 ساعة في مفاعل حيوي، iPSC في شكل مجاميع شكلها شكل فعال. كان المورفولوجيا مصانة جيدا حتى اليوم الخامس، مع زيادة تدريجية في الحجم.
إظهار درجة عالية من التجانس. وكشف التحليل الكمي عن طريق المجهر، أيضا التوزيع العادي، للأحجام الإجمالية حسب اليوم الأول، وحققت خطوط الخلية الحجم التجميعي الأمثل بحلول اليوم الثاني. بعد أن تم تحقيق القطر الكلي المطلوب ، تم تحريض الالتزام العصبي ، ومن ثم تم الترويج لجيل من ذريات cerebellar المختلفة.
خلال التمايز organoids، أظهرت الظهارة أكثر وضوحا مماثلة للهياكل العصبية مثل أنبوب مع الفضاء الإنارة. بالإضافة إلى ذلك، كان توزيع القطر العضوي، متجانسًا خلال الالتزام الأوّلي لـ cerebellar حتى اليوم 14. يدعم تحليل الفلوروسين المناعي ، أن الالتزام العصبي الفعال ، من الأعضاء المشتقة من iPSC ، يتحقق بالفعل ، بحلول اليوم السابع من التمايز.
كما أظهر التميّز المناعي التزامًا فعّالًا ل cerebellar ونضجًا فعالًا للأعضاء المُنقِد. وعلاوة على ذلك، بعد 80 يوما في مفاعل حيوي، ويعيش تلطيخ الميت من organoids أظهرت جدوى الخلية عالية، وليس هناك دليل على المناطق النخرية. هذه التقنية تمثل أداة هامة، لدراسة المسارات المرضية، والمشاركة في انحطاط cerebellar لوحظ في من و لتقييم الأثر العلاجي للأدوية الجديدة.
