Apresentamos pela primeira vez, uma nova abordagem para geração reprodutível e escalável, de células IPS derivadas de Organoides Cerebelares, e condições químicas definidas, utilizando bioreatores de uso único. Para obter células para semear o bio-reator, adicione um mililitro de meio de desprendimento celular, a cada poço de uma placa de seis poços de iPSC humanos. Incubar a placa a 37 graus Celsius por sete minutos, até que o tremor suave se desprende facilmente das células, do poço.
Usando uma micropipette P 1000, in pipeta o meio de descolamento celular, para cima e para baixo, até que as células se dissociem em células únicas. Em seguida, adicione dois mililitros, de cultura celular completa ao cada poço, isso irá inativar a digestão enzimática. Em seguida, use a pipeta, para transferir suavemente as células para um tubo cônico estéril.
Centrifugar o tubo a 210 vezes a gravidade por três minutos. Remova o supernasce e suspenda a pelota celular no meio da cultura. Conte as células usando um hemócito, e tinga azul trypan.
Veja o vaso bioreator com iPSC's, a uma densidade de 250.000 células por mililitro. Insira o vaso bioreator, na Unidade Base Universal, em uma incubadora a 37 graus Celsius, 95% de umidade e 5% de dióxido de carbono. Para promover a agregação do iPSC, defina a taxa de agitação da Unidade de Controle base para 27 RPM.
No primeiro dia, sendo o dia zero o dia da semeadura do bioreator, coloque o bioreator e a Unidade Base em uma coifa de fluxo estéril, em seguida, use uma pipeta sorológica, para coletar uma amostra de um mililitro, da suspensão celular. Aplaque a suspensão da célula em um acessório ultra baixo, placa de 24 poços. Use um microscópio, para confirmar que os agregados derivados do iPSC se formaram.
Se assim for, capture imagens dos agregados em 40 X ou 100 X.Continue culminando os iPSC's e o bioreator, até que o diâmetro médio dos agregados, seja de 100 micrômetros, depois substitua 80% do meio, por MT01 fresco sem inibidor de rocha. Quando os agregados, atingirem de 200 a 250 mímetros de diâmetro, deixe que todos os organoides se instalem, na parte inferior do bioreator, substitua todo o meio gasto, por meio de diferenciação gfCDM. Coloque a unidade base e o bioreator na incubadora e diminua a agitação para 25 RPM.
Depois de remover o supernazio dos organoides armazenados, adicione um mililitro de 15% de sacarose à pelota, e misture bem girando suavemente. Depois de incubar os organoides durante a noite, a quatro graus Celsius, remova a solução de sacarose, em seguida, adicione um mililitro de 15%, 7,5% de gelatina, e misture rapidamente girando suavemente. Enquanto os organoides estão incubando a 37 graus Celsius encher um recipiente plástico no meio do caminho com a solução de 15% de sacarose 7,5% de gelatina, e permitir que ele se solidifique.
Depois que os organoides tiverem sido incubados por uma hora, use uma pipeta Pasteur, para colocar uma gota da mistura de gelatina organoide de sacarose, em cima da sacarose solidificada e gelatina. Depois de esperar 15 minutos para que a gota se solidifique, encha o restante do recipiente plástico, com mais 15% de sacarose, 7,5%, permita solidificar completamente à temperatura ambiente e, em seguida, incuba-lo por 20 minutos a quatro graus Celsius. Corte a gelatina em um cubo, com os organoides no centro, fixe o cubo em um pedaço de papelão, com uma gota de composto OCT, em seguida, colocado 250 mililitros de Isopentane, em um copo de 500 mililitros, encha um recipiente apropriado, com nitrogênio líquido.
Usando fórceps e luvas grossas, coloque cuidadosamente a xícara de Isopentane, na superfície do nitrogênio líquido. Isotoentano e nitrogênios líquidos são reagentes perigosos. O uso desses dois reagentes requer equipamentos de proteção individual, incluindo luvas grossas e ventilação adequada.
Quando o Isopentane, esfriar para 80 graus Celsius negativos, coloque o cubo de gelatina no Isopentane até congelar. Um cubo bem congelado, produz um som metálico quando levemente tocado com fórceps, indicando que está pronto para ser armazenado. Lave os slides do microscópio contendo as seções organoides, com 50 mililitros 1X PBS por cinco minutos, depois transfira os slides para um frasco de Coplin, contendo PBS 1X fresco.
Transfira os slides para um frasco de Coplin, contendo 50 mililitros de glicina recém-preparada e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente, em seguida, transfira os slides para um frasco de Coplin, contendo 50 mililitros de 0,1% Triton, e permeabilizado por 10 minutos à temperatura ambiente. Lave os slides duas vezes com 1X PBS, por cinco minutos cada vez. Prepare o prato de imunostaining, com papel de três milímetros, embebido em 1X PBS.
Seque as lâminas com um tecido ao redor das fatias e coloque-as no papel de três milímetros. Com uma pipeta Pasteur, cubra cada slide com 0,5 mililitros de solução de bloqueio. Depois de incubar por 30 minutos à temperatura ambiente, remova a solução de bloqueio em excesso e dirija os slides com um tecido, ao redor das fatias.
Coloque 50 microliters de anticorpo primário diluído, em cada slide e cubra-os com deslizamentos de cobertura. Amarre os slides, no prato de imunostaining previamente preparado, e incuba-os a quatro graus Celsius. Após a incubação durante a noite, transfira os slides para um frasco de Coplin, com 50 mililitros de TBST, deixando os deslizamentos de cobertura caírem, depois lave os slides três vezes com TBST, por cinco minutos cada vez.
Coloque 50 microliters, de anticorpo secundário diluído em cada slide, e cubra com os deslizamentos de cobertura. Coloque os slides, no prato de imunostaining previamente preparado, incubar por 30 minutos em temperatura ambiente, protegido da luz. Transfira os slides para um frasco Coplin novamente, e lave-os três vezes com 50 mililitros de TBST, por cinco minutos cada vez.
Usando uma Pipeta Pasteur, a 0,5 mililitros de solução dappy, sobre toda a superfície de cada slide e incubar por cinco minutos em temperatura ambiente. Após 24 horas no bioreator, os agregados em forma de esferoide eficientemente formados pelo iPSC. A morfologia foi bem mantida até o quinto dia, com um aumento gradual no tamanho.
Demonstrando um alto grau de homogeneidade. Uma análise quantitativa por microscopia, também revelou distribuição normal, de tamanhos agregados até o primeiro dia, e ambas as linhas celulares atingiram o tamanho agregado ideal até o segundo dia. Após a alcançado a desejada diâmetro agregado, o compromisso neural foi induzido e, em seguida, a geração de diferentes progenitores cerebelares foi promovida.
Durante a diferenciação, os organoides apresentaram uma epitelialização mais pronunciada semelhante às estruturas semelhantes a tubos neurais com espaço luminal. Além disso, a distribuição do diâmetro organoide foi homogênea durante o compromisso cerebelar inicial até o dia 14. A análise da imunofluorescência sustenta que um compromisso neural eficiente, dos organoides derivados do iPSC, já é alcançado, no sétimo dia de diferenciação.
A imunostaining também demonstrou, o comprometimento cerebelar eficiente e a maturação eficiente dos organoides cerebelares. Além disso, após 80 dias no bioreator, a coloração morta viva de organoides mostrou alta viabilidade celular, e nenhuma evidência de áreas necrosas. Esta técnica representa uma importante ferramenta, para o estudo de vias patológicas, envolvida na degeneração do cerebelar observado e para avaliar o efeito terapêutico de novas drogas.
