يجمع بروتوكولنا بين العديد من التقنيات التي أثبتت فعاليتها في صيانة المواد العضوية على المدى الطويل. هذا مفيد لدراسة الشيخوخة في الأمراض المرتبطة بالعمر حيث تكون المظاهر السريرية خارج فترة النمو. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تتطلب أي معدات أو كواشف متخصصة.
يعتمد بشكل كبير على المواد الشائعة في المختبر. أصبحت الشيخوخة والأمراض التنكسية العصبية نقطة اهتمام خاصة حيث تركز طرق النمذجة الحالية لدينا في الغالب على الأنماط الظاهرية للأمراض الراسخة بدلا من مراحل النمو المبكرة. الخلايا الجذعية الجنينية والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات هي خلايا حساسة للغاية.
يجب أن يكون المستخدمون لأول مرة لطيفين وأن يتحلوا بالصبر. نظرا لأن هذه ثقافات طويلة الأجل ، يجب على المرء التحلي بالصبر من البداية للبدء ، رش 70٪ إيثانول على حبلا خياطة وقم بإعداد خيوط PLGA الدقيقة عن طريق تآكل حبلا الخيط بالطرف الحاد للمشرط. ضع الألياف تحت المجهر.
وباستخدام المسطرة ، ابدأ في تقطيع الألياف إلى أجزاء من خيوط طولها 500 ميكرومتر إلى ملليمتر واحد. قطع حوالي 25 ملم من الألياف في المجموع وإضافة خيوط في أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على ملليلتر واحد من محلول مضاد حيوي مضاد للفطريات. بعد ذلك في غطاء المحرك ، قم بتخفيف محلول الألياف ب 10 ملليلتر من DMEM / F-12 والدوامة لخلط جيدا.
ثم أضف 20 ميكرولترا من محلول الألياف إلى ثلاثة آبار من صفيحة 96 بئرا. باستخدام مجهر المجال الساطع ، قم بحساب ومتوسط الألياف لكل بئر. قم بتخفيف أو تركيز الآبار بمحلول الألياف بمتوسط 5 إلى 10 خيوط دقيقة لكل بئر.
بمجرد أن تصل الخلايا الجذعية المستحثة سابقا إلى التقاء 70 إلى 80٪ ، تحقق من الخلايا تحت المجهر عند تكبير 10 أو 20x. تأكد من أن المستعمرات تعرض أقل من 10٪ من مساحة التمايز التلقائي. نضح الوسط باستخدام ماصة وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام DPBS.
ثم أضف 500 ميكرولتر من محلول انفصال الخلايا أو 0.5 مليمول EDTA لفصل المستعمرات ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من وسائط E8 الطازجة إلى كل بئر وماصة برفق لفصل جميع الخلايا. انقل تعليق الخلية بالكامل إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر ، وأضف ملليلترا آخر من وسائط E8 الجديدة.
ثم ، قم بتدوير الخلايا عند 290 جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلتر واحد من وسائط E6 المكملة بمثبط 50 ميكرومولار ROCK وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم. قم بإعداد تعليق خلوي لكثافة الجلوس المطلوبة في وسائط E6 مع استكمال مثبط ROCK.
بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولترا من تعليق الخلية في كل بئر من لوحة ربط منخفضة للغاية تبلغ 96 بئرا. بعد ذلك ، قم بطرد اللوحة عند 290 جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة لإجبار تجميع الخلايا. بعد ذلك ، احتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لتكوين الجسم الجنيني.
بعد 24 ساعة من الحضانة ، انقل اللوحة إلى الغطاء واستنشق بعناية 120 ميكرولترا من الوسائط باستخدام ماصة ، مع الحرص على عدم استنشاق الجسم الجنيني عن طريق خفض طرف الماصة بعيدا جدا في البئر. بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولترا من وسائط E6 الطازجة المكملة باثنين من micromolar XAV939 ، ومثبطات SMAD لكل بئر. انقل اللوحة مرة أخرى إلى الحاضنة واستبدل الوسط يوميا ب E6 الطازج المكمل بالمثبطات.
في اليوم السابع من الحضانة ، تحقق مما إذا كانت جميع الأجسام الجنينية قد وصلت إلى قطر يتراوح بين 550 و 600 ميكرومتر وعرض حافة ناعمة وواضحة. في هذه المرحلة ، تكون جاهزة للتضمين في مصفوفة خارج الخلية. لتضمين المواد العضوية ، قم بإعداد صفائح التضمين المدملة عن طريق وضع ورقة فيلم سقف لدن بالحرارة بطول أربع بوصات على صندوق P200 فارغ.
بعد ذلك ، استخدم أنبوبا مخروطيا سعة 15 ملليلترا أو أنبوب طرد مركزي صغير سعة 500 ميكرولتر واضغط برفق على ورقة الفيلم في الثقوب لعمل 12 أو العدد المطلوب من الدمامل. بعد ذلك ، قم برش 70٪ من الإيثانول على ورقة الفيلم واتركها تجف داخل الغطاء مع إضاءة ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة على الأقل. وفي الوقت نفسه ، قم بإذابة كمية كافية من مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد.
بعد ذلك ، باستخدام طرف P200 عريض التجويف ، انقل جسما جنينيا واحدا من الصفيحة المكونة من 96 بئرا إلى كل غمازة. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسائط باستخدام طرف ماصة عادي ولكن لا تدع الجسم الجنيني يجف. بعد ذلك ، مع طرف P200 منتظم مبرد مسبقا ، أضف ما يقرب من 30 ميكرولترا من مصفوفة الغشاء غير المخففة إلى كل عنصر عضوي ، مما يضمن أن جسم الجنين قريب قدر الإمكان من مركز القطرة.
بمجرد تضمين جميع الأجسام الجنينية في المصفوفة ، ضع ورقة الفيلم في طبق بتري معقم. بعد ذلك ، احتضن طبق بتري عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في جو مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح لمصفوفة الغشاء بالتصلب. للتمايز العضوي ، أضف خمسة ملليلتر من وسائط التمايز المحضرة مع B-27 بدون فيتامين أ إلى بئر واحد من لوحة 6 آبار منخفضة للغاية.
سخن اللوحة إلى 37 درجة مئوية في حاضنة. بمجرد أن تصلب مصفوفة الغشاء ، انقل الأجسام الجنينية المضمنة إلى اللوحة المكونة من 6 آبار عن طريق دفع الدمامل من الجزء الخلفي من ورقة الفيلم. إذا لزم الأمر ، استخدم ملليلترا واحدا من الوسائط من البئر وقم بوضعه على الورقة لفصل القطرات عن ورقة الفيلم.
تمايزة الأجسام الجنينية المضمنة في مصفوفة الغشاء نحو الكائنات العضوية الدماغية التي تعرض تكوينات ناشئة مميزة نهارا في المختبر 10. في اليوم في المختبر 30 ، تنضج الكائنات العضوية باستخدام إما الدمل أو تضمين الساندويتش. تظهر الثقافة طويلة الأجل أن الكائنات العضوية الدماغية نمت إلى أحجام كبيرة.
في اليوم السابع في المختبر ، تعرض الأجسام الجنينية وريدات عصبية إيجابية SOX2 ، وخلايا عصبية غير ناضجة متناثرة ، وخلايا سلفية عصبية. بينما في النهار في المختبر 120 ، فإنها تظهر علامات عصبية ناضجة مثل MAP2 و NeuN. يمكن استخدام هذه العلامات الهيكلية الخلوية جنبا إلى جنب مع علامات ما بعد الانقسام الأخرى مثل doublecortin و synapsin للتحقيق في اللدونة المشبكية وغيرها من الانخفاضات المرتبطة بالعمر ، بالإضافة إلى أنسجة المخ الإضافية مثل الخلايا النجمية والدبقية.
ضمان بقاء حواف الأنسجة سليمة أمر بالغ الأهمية. لتقليل قوة القص الضارة ، يجب أن تتم الأنابيب ببطء ، على سبيل المثال ، أثناء تغيير الوسائط والتضمين العضوي. يسمح لنا النمو العضوي البطيء بدراسة تقدم المرض في المظاهر الخلوية المبكرة.
يمهد الخلق العضوي طريق الكشف المبكر في علاج العديد من الأمراض.
