يمكن أن تساعد هذه الطريقة في دراسة التطور المبكر للمخيخ البشري وكيف يمكن تغييره في الاضطرابات العصبية والنفسية. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي توليد خلايا مخيخية بشرية مبكرة من الناحية التنموية في بنية طبقة 2D دون تنفيذ خطوات معقدة. كما أنها فعالة من حيث التكلفة.
قد يكون صنع ماصات السحب أمرا صعبا في البداية ، ولكن مع الممارسة والوقت ، يصبح من الأسهل سحب الماصات بطريقة يسهل التعامل معها. ابدأ التحضير التجريبي بسحب ماصة باستور طولها 22.9 سم أسفل الرقبة بمقدار سنتيمترين تقريبا ، فوق موقد بنسن لإنشاء ماصات زجاجية. سيكون الجانب الأرق أقصر بأربعة سنتيمترات تقريبا من الآخر.
ثني أطراف الجانب المسحوب على اللهب لإنشاء R سلس ، ثم ضع الماصات المسحوبة في أكمام الأوتوكلاف وقم بتعقيمها في الأوتوكلاف. في اليوم صفر ، أضف ملليلترا واحدا من وسط تمايز المخيخ المكمل ب 10 ميكرومولار Y-27632 و SB-431542 إلى كل بئر من ملحق منخفض للغاية من ستة آبار ، أو ULA ، لوحة ، وضعه في الحاضنة حتى تصبح المستعمرات المرفوعة جاهزة للإضافة إلى الآبار. نظف الخلايا المتمايزة باستخدام ماصة زجاجية مسحوبة.
نضح الوسط وأضف ملليمتر واحد من محلول تمرير iPSC لكل طبق 35 ملم. بعد ثلاث دقائق من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، استنشق الوسط وأضف ملليمترين من وسط تمايز المخيخ المكمل ب 10 ميكرومولار Y-27632 و SB-431542 تحت تكبير 4x لمجهر مقلوب بالضوء المرسل ، ارفع المستعمرات باستخدام الحافة المنحنية للماصة الزجاجية المسحوبة. بمجرد رفع كل مستعمرة ، انقل جميع المستعمرات برفق إلى بئر واحد من لوحة ULA المكونة من ستة آبار باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر.
كرر هذه العملية لكل لوحة iPSC واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم الثاني ، أضف FGF2 إلى كل بئر لضبط التركيز النهائي البالغ 50 نانوجرام لكل ملليلتر. في اليوم السابع، قم بتغيير ثلث الوسط عن طريق استنشاق ملليلتر واحد من الوسط المستهلك واستبداله بملليلتر واحد من وسط تمايز المخيخ الجديد.
احتضان الأجسام الجنينية لمدة سبعة أيام. في اليوم 14 ، قم بتدوير اللوحة لجمع كل الأجسام الجنينية في وسط اللوحة. ثم قم بإمالة اللوحة وشفط كل الوسط المستهلك باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر من الحافة.
مع انخفاض الكمية المتوسطة ، ضع اللوحة ببطء بشكل مسطح واستمر في الشفط ، تاركا وسطا كافيا لتجنب سحب الأجسام الجنينية. بعد ذلك ، أضف ثلاثة ملليلتر من وسط تمايز المخيخ الطازج مع 10 ميكرومولار Y-27632. ثم انقل الأجسام الجنينية باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر إلى طبق مطلي ب Poly-L-Ornithine Laminin.
في اليوم 15 ، استنشاق الوسط واستبداله بوسط تمايز مخيخي جديد. في اليوم صفر ، تم تنظيف مستعمرات iPSC ورفعها إلى وسط تمايز مخيخي يحتوي على SB-431542 و Y-27632 وتم وضعها في ألواح ربط منخفضة للغاية لتوليد أجسام جنينية. أدت إضافة FGF2 في اليوم الثاني وتغيير 1/3 وسيط في اليوم السابع إلى تضخم الأجسام الجنينية في اليوم الرابع عشر.
بدأت الخلايا تهاجر إلى الخارج من الأجسام الجنينية على طول السطح المطلي في اليوم 15. أدى التغيير الكامل للوسط إلى وسط النضج المخيخي من اليوم 21 إلى طبقة أحادية من الخلايا ذات التشكل الشبيه بالخلايا العصبية والتعقيد بحلول اليوم 35. كشف تحليل التعبير الجيني في اليوم 35 أن الخلايا تعبر عن علامات السلف المخيخي المبكرة مثل السلف glutamatergic ، ATOH1 ، GABAergic progenitors ، PTF1 alpha ، وعلامات الخلايا السلفية Purkinje KIRREL2 و SKOR2.
بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ أيضا التعبير عن علامة الشفاه المعينية OTX2 ومعظمها SIX3 الخاص بالخلايا العصبية الأمامية. أظهر وضع العلامات المناعية للخلايا التي تم حصادها في اليوم 35 تلطيخا إيجابيا لعلامات المخيخ EN2 و PTF1 alpha ، والعلامة العصبية بيتا توبولين III ، وعلامة الانتشار KI67. أظهر التلوين النووي مع 4'6-diamidino-2-phenylindole ، أو DAPI ، نوى الخلية.
من أجل التمايز الناجح ، من الأهمية بمكان البدء بمستعمرات iPSC صحية وغير متمايزة واستخدام الكواشف التي يتم إعادة تشكيلها حديثا قدر الإمكان.
