يصف هذا البروتوكول الجديد استخدام تسلسلات متعددة متميزة من الحمض النووي الاصطناعية تحاكي غاما السلطة الوطنية الفلسطينية لتشكيل الهياكل النانوية في مخاليط المذيبات العضوية محددة. وتبين عمليات الفحص الموصوفة هنا الحاجة إلى تكييف بروتوكولات النانو الموجودة في مجال تكنولوجيا الحمض النووي نحو المذيبات العضوية حيث لم يتم نشر بروتوكولات تذكر. الممارسين الجدد لهذه التقنية قد تجد صعوبة في التكيف مع البروتوكولات القائمة وضعت لبيئات غنية مائي في بيئات العضوية الغنية بالمذيبات بسبب ميل السلطة الوطنية الفلسطينية للمواد النانوية لتجميع.
تبدأ من خلال إعداد مخزونات السلطة الوطنية الفلسطينية غاما. بعد الحصول على خيوط منقيّة من فئة HPLC من شركة تصنيع تجارية، قم بإعادة تركيز كل خصلة في المياه غير المتينة إلى 300 تركيزات ميكرومولار. تخزين PNAs غاما في ناقص 20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عدة أشهر.
عندما تكون جاهزة لأداء التجميع الذاتي، وإعداد عينات دفعة مناجل في 75٪ DMSO، 75٪ DMF، و 40٪ 1، 4-dioxane. أولاً، إعداد 20 من الأرصدة الفرعية الدقيقة من كل 10 ميكروجيرات عن طريق إعادة 0.67 ميكرولترات من المخزون الرئيسي وإضافة المياه الأيونية لحجم نهائي من 10 ميكرولترات. إضافة ميكرولتر واحد من كل oligomer من 20 submolar substocks إلى 200 ميكرولتر PCR أنبوب، والتي سوف تأتي إلى حجم إجمالي قدره تسعة ميكرولترات لتسعة oligomers.
إضافة 30 ميكرولترات من DMSO أو DMF اللامائية مع ميكرولتر واحد إضافي من المياه ديوند لحجم النهائي من 40 ميكرولترات. لإعداد 40٪ 1، 4-الديوكسيان دفعة، إضافة 16 ميكرولترات من 1، 4-الديوكسيان وتقديم وحدة التخزين إلى 40 ميكرولترات مع المياه الأيونية. عينات الـ(آنال) لمدة 22.5 ساعة في دورة حرارية تبرد من 90 إلى 20 درجة مئوية.
عادة، ذوبان درجات الحرارة التي تم الحصول عليها لاثنين من القلة وثلاثة oligomer غاما السلطة الوطنية الفلسطينية فرعية تقع في حدود 40 إلى 70 درجة مئوية لظروف المذيبات المختلفة. برمج دورة حرارية وفقا لاتجاهات المخطوطات. وبمجرد اكتمال التلاهم، يمكن تخزين العينات عند أربع درجات مئوية لمدة 12 إلى 24 ساعة قبل التوصيف.
جعل غرفة الرطوبة من مربع نصائح ماصة فارغة عن طريق ملء مربع مع ما يقرب من خمسة ملليلتر من الماء. إعداد تخفيف 20 أضعاف من 2٪ coll المتاحة تجاريا في خلات اميل مع مذيبات الأسيات ايزوميل لإنشاء حل nitrocellulose. استخدام ملاقط لتراجع غطاء في حل النيتروسليلوز والسماح لها لتجف الهواء، ثم جعل غرفة تدفق من شريحة المجهر، واثنين من أشرطة الشريط على الوجهين، وأغطية النيتروسليلوز المغلفة.
إعداد محلول BSA البيوتين عن طريق وزنها ملليغرام واحد من البيوتين BSA وحلها في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. Pipette 15 ميكرولترات من BSA الحيوية في قناة تدفق في زاوية واحتضان لمدة دقيقتين إلى أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطب. ضربة 15 ميكرولترات من العازلة الغسيل، والتي تتكون من ملليغرام واحد من BSA في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني، في القناة لغسل الزائدة البيوتين BSA، ثم تزدجم السطح عن طريق احتضان قناة تدفق لمدة دقيقتين إلى أربع دقائق في غرفة مرطبة.
قياس 0.5 ملليغرام من streptavidin ومليغرام واحد من BSA، ثم حل كليهما في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. Pipette 15 ميكرولترات من محلول streptavidin في قناة التدفق ووضعها في غرفة مرطب لمدة دقيقتين إلى أربع دقائق وغسل القناة عن طريق تدفق 15 ميكرولترات من عازلة الغسيل. بعد ذلك ، تدفق 15 ميكرولترات من دفعة من oligomers غاما PNA في غرفة مرطب ، ثم غسل الهياكل النانوية غير منضمة من خلال تدفق 15 ميكرومترات من Trolox ملليمولار واحد في نفس تكوين المذيبات مثل الهياكل النانوية.
نقل قناة التدفق إلى حامل الشريحة وصورتها مع مجهر الفلوريسكين مجهزة التصوير TIRF، هدف غمر النفط 60X، ومكبر 1.5X. مسح قناة تدفق إما في 60 أو 90X التكبير أثناء مراقبة قناة Cy3. إعداد 20 و 6٪ SDS الأسهم وفقا لاتجاهات المخطوطات، ثم الحنع أشعة غاما PNA oligomers بإضافة ميكرولتر واحد من كل 20 القلة الدقيقة إلى 200 ميكرولتر PCR أنبوب.
إضافة 30 ميكرولترات من DMSO اللامائية وميكر واحد من 6٪ أو 20٪ SDS إلى أنابيب PCR لحجم النهائي من 40 ميكرولترات، والتي سوف تؤدي إلى تركيز SDS النهائي من 5.25 أو 17.5 ملليمولار على التوالي. الينغال PNAs غاما في الدراجات الحرارية كما سبق وصفه. تميز البنية النانوية لـ GAMMA PNA في وجود SDS باستخدام بروتوكول TIRF أو TEM.
أظهر تصوير TIRF لـ oligomers من نوع غاما PNA المُحند في 75٪ DMSO أبنية منظمة تنظيمًا جيدًا بينما أدى التلوي في 75٪ DMF إلى هياكل نانوية على شكل حار أو تشبه الإبر. أنتجت حالة 40٪1، 4-dioxane زخرفة متناثرة من الهياكل النانوية الخيطية. وعلاوة على ذلك، أظهرت عينات من الأنابيب النانوية غاما PNA تشكلت في 75٪ DMSO تجميع الألياف النانوية في التكبير عالية أو قرارات nanoscopic خلال التصوير TEM.
وأظهر التحليل الكمي لعرض الهياكل النانوية أن متوسط عرضها 16.3 نانومتر مع قيم قصوى تتجاوز 80 نانومتر. شكلت أوليجومات الحمض النووي النمائية التي حلت محل الحمض النووي غاما المتجاور هياكل خيوطية مستقيمة في حين أن استبدال الأحماض النووية جاما كروس يؤدي إلى هياكل ممتازة. وكان متوسط عرض الهياكل النانوية التي تم استبدالها بأليجومرات الحمض النووي المتجاورة حوالي 19 نانومتر.
في تركيزات SDS عالية، تعتمد ألياف النانو غاما PNA أيضًا ألياف مورفولولوجيا شبكية للغاية مقارنةً بتركيزات micelle الحرجة عند النظر إليها باستخدام تصوير TIRF. يشير التصوير TEM إلى أن تجميع جاما السلطة الوطنية الفلسطينية في 5.25 ملليمولار SDS لديه أكبر تخفيضات كبيرة في تجميع الهيكلية. عند محاولة هذا البروتوكول، من المهم أن نتذكر للحفاظ على تكوينات المذيبات كما ذكر بسبب ميل الهياكل النانوية إلى التجميع.
هذه الأساليب تشجع الممارسين على متابعة سبل أخرى غير مستكشفة من مختلف تركيبات المذيبات، السطحي، وغيرها من الهياكل النانوية DNA السلطة الوطنية.
