Este novo protocolo descreve o uso de múltiplas sequências distintas do ácido nucleico sintético imitar gamma PNA para formar nanoestruturas em misturas específicas de solventes orgânicos. Os ensaios aqui descritos mostram a necessidade de adaptar protocolos de nanotecnologia de ácido nucleico existentes em relação a solventes orgânicos onde pouco ou nenhum protocolo foi publicado. Os praticantes novos nesta técnica podem ter dificuldade em adaptar protocolos existentes desenvolvidos para ambientes ricos em ambientes orgânicos ricos em solventes devido à propensão do PNA nanomaterial a agregar.
Comece preparando as ações gama PNA. Após a obtenção de fios de gama PNA purificados de grau HPLC de um fabricante comercial, resuspenda cada fio em água deionizada para 300 concentrações de micromolar. Armazene as PNAs gama a menos 20 graus Celsius por até vários meses.
Quando estiver pronto para realizar o automontagem, prepare amostras de lote anneal em 75% DMSO, 75% DMF e 40%1, 4-dioxano. Primeiro, prepare 20 substocks micromolar de cada oligômero, aliquoting 0,67 microliters do estoque principal e adicionando água deionizada para um volume final de 10 microliters. Adicione um microliter de cada oligômero dos 20 subabas micromolares a um tubo PCR de 200 microliteres, que chegará a um volume total de nove microlitadores para nove oligômeros.
Adicione 30 microliters de DMSO anidro ou DMF com um microliter adicional de água deionizada para um volume final de 40 microliters. Para preparar o lote 40%1, 4-dioxano, adicione 16 microliters de 1, 4-dioxano e leve o volume para 40 microliters com água deionizada. Ressuem as amostras por 22,5 horas em um cicloviário térmico esfriando de 90 a 20 graus Celsius.
Tipicamente, as temperaturas de fusão obtidas para dois subconjuntos oligômeros e três subconjuntos oligômeros gama PNA estão na faixa de 40 a 70 graus Celsius para diferentes condições de solvente. Programe o cicloviário térmico de acordo com as instruções do manuscrito. Uma vez concluída a ressarização, as amostras podem ser armazenadas a quatro graus Celsius por 12 a 24 horas antes da caracterização.
Faça uma câmara de umidade a partir de uma caixa vazia de pontas de pipeta enchendo a caixa com aproximadamente cinco mililitros de água. Prepare uma diluição 20 vezes disponível comercialmente em acetato de amilo com solvente de acetato de isoamíl para criar a solução de nitrocelulose. Use pinças para mergulhar uma mancha na solução de nitrocelulose e permitir que ela seque ao ar, em seguida, faça uma câmara de fluxo de um slide de microscópio, duas tiras de fita de dois lados e a tampa revestida de nitrocelulose.
Prepare a solução biotina BSA pesando um miligrama de biotina BSA e dissolvendo-a em um mililitro de PBS. Pipeta 15 microliters da biotina BSA no canal de fluxo em um ângulo e incuba-lo por dois a quatro minutos à temperatura ambiente na câmara umidificada. Sopre 15 microlitadores do tampão de lavagem, que consiste em um miligrama de BSA em um mililitro de PBS, no canal para lavar o excesso de biotina BSA, em seguida, passivar a superfície incubando o canal de fluxo por dois a quatro minutos na câmara umidificada.
Meça 0,5 miligramas de streptavidina e um miligrama de BSA, depois dissolva ambos em um mililitro de PBS. Pipeta 15 microliters da solução streptavidin no canal de fluxo e colocá-lo na câmara umidificada por dois a quatro minutos e lavar o canal fluindo 15 microliters de tampão de lavagem. Em seguida, flua 15 microlitadores do lote de oligômeros gama PNA na câmara umidificada, em seguida, lave as nanoestruturas desvinculadas fluindo 15 microlitadores de um Trolox mililitro na mesma composição de solventes que as nanoestruturas.
Transfira o canal de fluxo para o suporte de slides e imagem-o com um microscópio de fluorescência equipado com imagem TIRF, um objetivo de imersão de óleo de 60X e uma lupa de 1,5X. Escaneie o canal de fluxo em ampliação de 60 ou 90X enquanto monitora o canal Cy3. Prepare 20 e 6% estoques de SDS de acordo com as instruções do manuscrito, em seguida, anneal os oligômeros gama PNA adicionando um microliter de cada 20 oligômeros micromolar a um tubo PCR de 200 microliter.
Adicione 30 microliters de DMSO anidro e um microliter de 6%ou 20% SDS aos tubos PCR para um volume final de 40 microlitadores, o que resultará em uma concentração final de SDS de 5,25 ou 17,5 mililitros, respectivamente. Anneal o gamma PNAs no termociclador como descrito anteriormente. Caracterizar nanoestruturas gama PNA na presença de SDS utilizando o protocolo TIRF ou TEM.
As imagens TIRF de oligômeros gama PNA encolhidos em 75%DMSO mostraram arquiteturas bem organizadas enquanto a ressarição em 75% DMF resultou em nanoestruturas em forma de espícula ou agulha. A condição de 40%1, 4-dioxano produziu uma decoração esparsa de nanoestruturas filamentosas. Além disso, as amostras de nanotubos gama PNA formados em 75% DMSO demonstraram agrupamento de nanofibras em altas ampliações ou resoluções nanoscópicas durante a imagem TEM.
A análise quantitativa da largura das nanoestruturas mostrou uma largura mediana de 16,3 nanômetros com valores máximos além de 80 nanômetros. Os oligômeros de DNA isosequenciais que substituíram os PNAs gama contíguos formaram estruturas retas filamentosas, enquanto a substituição das PNAs de gama transversal resultam em estruturas estelares. As nanoestruturas que foram substituídas por oligômeros de DNA contíguos tinham larguras medianas de cerca de 19 nanômetros.
Em altas concentrações de SDS, as nanofibras gama PNA também adotam morfologias altamente em rede em comparação com suas concentrações críticas de micela quando vistas com imagens TIRF. A imagem TEM indica que o conjunto gama PNA em SDS de 5,25 milimililar tem as reduções mais substanciais no agrupamento estrutural. Ao tentar este protocolo, é importante lembrar de manter as composições solventes como mencionado devido à propensão das nanoestruturas a agregar.
Esses métodos encorajam os praticantes a buscar outras avenidas inexploradas de diferentes composições de solventes, surfactantes e outras nanoestruturas de DNA PNA.
