이 새로운 프로토콜은 특정 유기 용매 혼합물에서 나노 구조를 형성하기 위해 합성 핵산 모방 감마 PNA의 여러 고유 서열의 사용을 설명합니다. 여기에 설명된 분석법은 프로토콜이 거의 또는 전혀 없는 유기 용매를 향해 기존의 핵산 나노 기술 프로토콜을 적응할 필요성을 보여줍니다. 이 기술에 새로운 실무자는 나노 물질 PNA의 성향으로 인해 수성이 풍부한 환경을 위해 개발 된 기존 프로토콜을 응집하기 어려울 수 있습니다.
감마 PNA 주식을 준비하여 시작합니다. 상업 제조업체로부터 HPLC 등급 정제 감마 PNA 가닥을 얻은 후, 300 마이크로 몰라 농도로 탈이온 된 물에 각 가닥을 다시 중단합니다. 감마 PN을 섭씨 영하 20도까지 최대 몇 개월 동안 보관하십시오.
자체 조립을 수행할 준비가 되면 75%DMSO, 75%DMF 및 40%1, 4-다이옥산으로 막음 배치 샘플을 준비합니다. 먼저, 메인 스톡에서 0.67 마이크로리터를 알리싱하고 10마이크로리터의 최종 부피에 대한 탈이온화된 물을 추가하여 각 올리고머의 20개의 마이크로몰라 서브스톡을 준비한다. 20 마이크로 몰러 서브 스톡에서 각 올리고머의 마이크로 리터 를 200 마이크로 리터 PCR 튜브에 추가하면 9 개의 올리고머에 대한 총 9 마이크로 리터가 제공됩니다.
40 마이크로리터의 최종 부피에 대한 deionized 물의 추가 1 마이크로 리터와 무수 DMSO 또는 DMF의 30 마이크로 리터를 추가합니다. 40%1, 4-디옥산 배치를 준비하려면 1, 4-디옥산16 마이크로리터를 추가하고 탈이온화된 물로 40 마이크로리터에 부피를 가져옵니다. 90에서 20 °C까지 냉각 열 사이클러에서 22.5 시간 동안 샘플을 음안합니다.
일반적으로, 2개의 올리고머와 3개의 올리고머 감마 PNA 서브세트에 대해 얻어진 용융 온도는 다른 용매 조건에 대해 섭씨 40~70도범위에 속한다. 원고 의 지시에 따라 열 사이클러를 프로그래밍합니다. 어닐링이 완료되면 특성화 전에 12~24시간 동안 샘플을 섭씨 4도에 저장할 수 있습니다.
빈 파이펫 팁 박스에서 약 5밀리리터의 물로 상자를 채우십시오. 니트로셀룰로오스 용매를 생성하기 위해 이소아밀 아세테이트 용매와 아밀 아세테이트에서 20배의 상용화 가능한 2%콜로디온을 준비한다. 핀셋을 사용하여 니트로셀룰로오스 용액에 커버슬립을 담근 다음 공기 건조를 허용한 다음 현미경 슬라이드, 양면 테이프 스트립 2개, 니트로셀룰로오스 코팅 커버슬립에서 유동 챔버를 만듭니다.
비오틴 BSA 의 1 밀리그램을 계량하고 PBS의 1 밀리리터로 용해하여 비오틴 BSA 솔루션을 준비하십시오. 피펫 15 비오틴 BSA의 마이크로리터는 비스듬히 유량 채널로 들어가 가습 챔버의 실온에서 2~4분 동안 배양한다. PBS의 1 밀리리터에서 BSA 1밀리그램으로 구성된 세척 버퍼의 15 마이크로리터를 채널로 날려 여분의 비오틴 BSA를 씻어내고, 가습 챔버에서 2~4분 동안 유동 채널을 배양하여 표면을 통과시한다.
측정 0.5 스트렙타비딘의 밀리 그램과 BSA의 1 밀리그램, 다음 PBS의 1 밀리 리터에 모두 용해. 스테프타비딘 용액의 피펫 15 마이크로리터는 유동 채널에 넣고 가습 챔버에 2~4분 동안 배치하고 15마이크로리터의 세척 버퍼를 흐르고 채널을 세척한다. 다음으로, 가습 챔버에서 감마 PNA 올리고머의 아닐배치의 15마이크로리터를 응모한 다음, 나노구조와 동일한 용매 조성물에서 1밀리알러 트룰록의 15마이크로리터를 흐르고, 비바운드 나노구조를 세척한다.
TIRF 이미징, 60X 오일 침지 목표 및 1.5배 확대기가 장착된 형광 현미경으로 플로우 채널을 슬라이드 홀더로 전송하여 이미지를 이미지화합니다. Cy3 채널을 모니터링하는 동안 60배율 또는 90X 배율로 유동 채널을 스캔합니다. 원고 방향에 따라 20 및 6 %의 SDS 주식을 준비한 다음 20 마이크로 리터 PCR 튜브에 각 20 마이크로 몰리어 올리고머의 마이크로 리터 1 개를 추가하여 감마 PNA 올리고머를 음멸합니다.
30개의 무수DMSO와 6% 또는 20%의 마이크로리터를 PCR 튜브에 추가하여 40마이크로리터의 최종 부피를 차지하며, 이로 인해 최종 SDS 농도가 각각 5.25 또는 17.5밀리미터가 생성됩니다. 이전에 설명한 대로 열순환기의 감마 PNA를 음닐. TIRF 또는 TEM 프로토콜을 사용하여 SDS가 있는 감마 PNA 나노 구조를 특성화한다.
75%DMSO에서 아닐링된 감마 PNA 올리고머의 TIRF 이미징은 잘 조직된 아키텍처를 보였으며 75%DMF의 아닐링은 경피 모양 또는 바늘 모양의 나노 구조로 이어졌습니다. 40%1, 4-디옥산 상태는 필라멘트 나노 구조의 희소한 장식을 생산했다. 더욱이, 75%DMSO로 형성된 감마 PNA 나노튜브의 샘플은 TEM 이미징 동안 높은 배율 또는 나노스코프 해상도에서 나노섬유의 번들링을 시연하였다.
나노 구조의 폭의 정량적 분석은 80 나노미터를 초과하는 최대 값을 가진 16.3 나노미터의 중앙값을 나타냈다. 인접한 감마 PNA를 대체한 이소결과 DNA 올리고머는 직선 필라멘트 구조를 형성한 반면 크로스오버 감마 PNA를 교체하면 스텔레이트 구조가 발생합니다. 인접한 DNA 올리고머로 대체된 나노 구조는 약 19 나노미터의 중앙폭을 가졌다.
높은 SDS 농도에서 감마 PNA 나노 섬유는 TIRF 이미징으로 볼 때 중요한 미셀 농도에 비해 고도로 네트워크된 형태를 채택합니다. TEM 이미징은 5.25 밀리머 SDS의 감마 PNA 조립이 구조적 번들에서 가장 실질적인 감소를 나타낸다. 이 프로토콜을 시도할 때, 나노 구조의 경향 때문에 거재되는 용매 조성물을 유지하는 것이 중요하다.
이러한 방법은 실무자가 다른 용매 조성물, 계면 활성제 및 기타 PNA DNA 나노 구조의 다른 미개척 길을 추구하도록 장려합니다.
