يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الكشف عن الاختلافات بين الفطريات والثدييات على المستوى الجزيئي. ويمكن الاستفادة من هذه الاختلافات لتحديد النُهج العلاجية الجديدة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تعدل بشكل أكثر كفاءة جينوم C.Albicans من تقنيات إعادة التركيب المتماثلة الكلاسيكية.
لتحديد تسلسل الدليل RNA تحديد تسلسل PAM NGG قريبة من مكان codon وقف سيتم إدراج. يظهر هنا ، هي جميع تسلسل PAM وجدت في أول 100 من أزواج قاعدة TPK2 ، وهو دوري AMP kinase subunit الحفاز. تحديد الدليل الأمامي التمهيدي تسلسل ثلاثة.
هذا التسلسل سيكون 20 قواعد مباشرة من المنبع من موقع PAM NGG ولن تحتوي على أكثر من خمسة T في صف واحد. غادر انقر على قاعدة مباشرة من المنبع NGG واسحب المؤشر 20 القواعد. ثم، انقر على اليسار على علامة التبويب التمهيدي لإضافة التمهيدي.
الآن ، وتحديد الدليل العكسي التمهيدي تسلسل ثلاثة ، والتي ستكون مجاملة لتسلسل دليل إلى الأمام. لعق اليسار على قاعدة مباشرة من المنبع NGG واسحب المؤشر 20 قواعد. لكل التمهيدي ، انقر على اليسار على علامة التبويب التمهيدي لإضافة التمهيدي.
انقر بزر الماوس الأيمن فوق التمهيدي وحدد بيانات النسخ التمهيدي. قم بلصق التسلسلات في برنامج تحرير نص. إضافة تسلسلات متدلية إلى الأمام وعكس دليل oligos لتسهيل الاستنساخ.
إضافة تسلسل النيوكليوتيد ATTTG إلى نهاية خمسة رئيس الوزراء من دليل إلى الأمام التمهيدي ثلاثة وإضافة G إلى نهاية ثلاثة رئيس الوزراء من دليل إلى الأمام التمهيدي ثلاثة. وأخيرا، في تسلسل النيوكليوتيد AAAAC إلى نهاية خمسة رئيس من الدليل العكسي التمهيدي ثلاثة وإضافة C إلى نهاية ثلاثة رئيس من الدليل العكسي ثلاثة قبل الشراء. اختبار صبغة على الوجه الأمثل cas9 موجه التعبير عن طريق إضافة pv1524، 10x العازلة، bs9b1، والماء إلى 50 لتراً ميكرو في أنبوب 1.5 ملليلتر واحتضان في 55 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
يبرد خليط الهضم إلى درجة حرارة الغرفة وتدور لمدة 30 ثانية في 2348 مرات G لجلب التكثيف إلى الجزء السفلي من الأنبوب. لعلاج phosphatase العمود الفقري هضم، إضافة ميكرولتر واحد من العجل الأمعاء Phosphatase إلى خليط الهضم. احتضان رد الفعل في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة قبل.
الآن، الفوسفورية والفول إلى الأمام دليل التمهيدي ثلاثة والدليل العكسي التمهيدي ثلاثة، من خلال الجمع بينها مع 10x T4 Ligase العازلة، T4 Polynucleotide كيناز، والماء في أنبوب PCR. إضافة 10x T4 Ligase العازلة، T4 Polynucleotide كيناز، والمياه الصف البيولوجيا الجزيئية إلى أنبوب PCR الثاني كتحكم سلبي. احتضان خليط التفاعل في ثيرموسيكلير في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
تبريد الخليط في أبطأ معدل منحدر إلى 16 درجة مئوية إلى أن ينجلي oligos. ثم احتضان خليط القلد oligo في 4 درجات مئوية. الآن ligate oligos محن إلى PV1524 هضم.
في أنبوب PCR الأول، إضافة 10x T4 Ligase العازلة، T4 الحمض النووي Ligase، مزيج oligo محن، هضم CIP المعالجة البلازميد النقي، والماء إلى 10 ميكرولتر الحجم الإجمالي. وبالمثل إعداد أنبوب PCR الثاني باستخدام خليط التحكم السلبي بدلا من مزيج oligo محن. احتضان كلا الأنابيب في ثيرموساير في 16 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتبرد أخيرا إلى 25 درجة مئوية.
بعد الربط، وتحويل الخلائط الربط إلى خلايا المختصة كيميائيا ومن ثم تنقية وتسلسل البلازميدات كما هو موضح في بروتوكول النص. لتصميم قالب الإصلاح، إدراج كودون وقف عن طريق النقر على اليسار في تسلسل الجينات وإضافة النيوكليوتيدات التي ترميز كودون وقف وتقييد موقع الهضم. غادر فوق 10 قواعد المصب من حيث سيتم إجراء طفرة واسحب المؤشر 60 قواعد المنبع.
لعق اليسار على علامة التبويب التمهيدي لإضافة التمهيدي. سيؤدي هذا إلى إضافة قالب الإصلاح إلى الأمام ثلاثة. ثم غادر انقر فوق 10 قواعد المنبع من حيث سيتم إجراء الطفرة واسحب المؤشر 60 قواعد المصب.
انقر على اليسار على علامة التبويب التمهيدي لإضافة التمهيدي. سيؤدي هذا إلى إضافة قالب الإصلاح عكس ثلاثة. لإنشاء قالب الإصلاح، إضافة التمهيدي قالب إصلاح إلى الأمام، إصلاح التمهيدي عكس قالب، ثلاثي الفوسفات ديوكسي نوكليوتيد، العازلة، بوليمراز TACH، والمياه إلى كل من أنابيب PCR الأربعة.
الآن تنفيذ التمهيدي التمديد من خلال تشغيل ما بين 20 و 30 جولات من PCR. لهضم plasmids المستنسخة بشكل صحيح، إضافة plasmid، 10x العازلة، البومين مصل البقر، KPN 1، SAC 1، والمياه إلى 40 ميكرولتررس الحجم الكلي في أنبوب 1.5 ملليلتر. احتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
وفي الوقت نفسه، تنمو ثقافة بين عشية وضحاها من C.albicans SC5314، بروتروف البرية من النوع، في 25 درجة مئوية في uridine تكمل YPD. تنمو الثقافة إلى كثافة بصرية في 600 نانومتر أو OD 600 من أقل من ستة. بيليه خمس وحدات OD 600 من الخلايا في كل تحويل عن طريق الغزل لمدة خمس دقائق في 2348 مرات G.ثم تعليق الخلايا بيليت في 100 ميكرولترات من TE / ليثيوم خلات.
الآن، إلى أنبوب 1.5 ملليلتر وفي النظام، إضافة الخلايا التي أعيد تعليقها، مسلوقة وسريعة التبريد الحمض النووي الحيوانات المنوية السلمون، هضم البلازما، قالب إصلاح تنقية، وعازل لوحة. إعداد سيطرة سلبية بنفس الطريقة، باستثناء استبدال الماء في حجم يساوي ذلك من الحمض النووي تحويل. بعد احتضان التحولات بين عشية وضحاها ، والحرارة تشاك الخلايا عن طريق وضعها في حمام الماء 44 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة.
تدور لمدة خمس دقائق في 2348 مرات G في جهاز طرد مركزي أعلى مقاعد البدلاء وإزالة خليط لوحة متراكبة. غسل مرة واحدة عن طريق إضافة ملليلتر واحد من أوريدين تكمل YPD والطرد المركزي مرة أخرى. بعد تعليق الخلايا في 0.1 ملليلتر من YPD Uridine، احتضان التعليق على طبل الأسطوانة أو شاكر في 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي، لوحة الخلايا على Uridine تكمل YPD مع 200 ميكروغرام لكل ملليلتر من نورسيوثيريسين. سوف تظهر المستعمرات في غضون يومين إلى خمسة أيام وينبغي أن تكون مُلَكَسة لمستعمرات مفردة كما هو موضح في بروتوكول النص. لتنفيذ PCR مستعمرة، تصميم التمهيدي الاختيار إلى الأمام حول أزواج قاعدة 200 يصل تيار من موقع تقييد التي تم تقديمها، فضلا عن التمهيدي العكسي حوالي 300 أزواج قاعدة المصب.
إضافة 0.3 microliters من التمهيدي الاختيار إلى الأمام، 0.3 microliters من التمهيدي الاختيار العكسي، 0.3 microliters من البوليميراز thermostable، وثلاثة ميكرولترات من dNTP، وثلاثة ميكرولترات من XTAC العازلة، و 23 ميكرولترات من الماء إلى أنبوب. ثم إضافة 0.25 ميكرولترات من مستعمرة خميرة واحدة إلى الخليط باستخدام طرف P10 ماصة والحرص على عدم إزعاج ager. بعد تضخيم الحمض النووي عن طريق PCR، تشغيل خمسة ميكرولترات من PCR على هلام لضمان التضخيم هو ناجح، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه حطام الخلية في الجزء السفلي من الأنبوب.
تظهر هنا نتائج تمثيلية لتحرير الجينوم بوساطة CRISPR في C.Albicans. تم تحويل C.Albicans مع RNAs دليل وقوالب الإصلاح التي تستهدف C.Albicans TPK2. موقع هضم تقييد EcoR1 وإيقاف codons في قالب الإصلاح يعطل موقع PAM ويسهل الفحص للمتحولين الصحيحين.
مستعمرة PCR تليها الهضم تقييد يميز بسرعة نوع البرية من تسلسل تحريرها. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن نتحقق من نسخ متعددة من دليل RNAs المستنسخة في PV1524. لأن هذا سوف يقلل من كفاءة تحرير الجينوم.
لا تنسى، C.Albicans هو مسببات الأمراض BL2، ودائما حيث الملابس مختبر المناسب واتبع جميع إجراءات السلامة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
