يوفر هذا البروتوكول تقنية لزيادة كفاءة 96-جيدا تحميل لوحة استخراج الحمض النووي dna بينما في الوقت نفسه خفض خطر التلوث عبر العينة. هذه التقنية يقلل من فرص التلوث خلال الخطوة الأولى الحرجة من استخراج الحمض النووي من خلال إضافة عينات فردية إلى كل بئر في لوحة 96 جيدا. ويمكن تطبيق هذه المنهجية على أي من المجالات المتنوعة للبحوث الميكروبيوم.
قبل البدء في تجربة، ضباب أعلى مقاعد البدلاء مع 70٪الإيثانول. بعد المسح، والسماح لمقاعد البدلاء الهواء الجافة قبل رش مقاعد البدلاء مع 10٪التبييض. بعد المسح وتجفيف الهواء، تراجع المقص الجراحي المجهري، بصق، ومنحني في 95٪ الإيثانول وفضح الأدوات لهب.
ثم تراجع كل أداة في 10٪ التبييض والسماح للأدوات لتجف الهواء. قبل أخذ العينات الفرعية، يعقم الإيثانول القفازات ويتجانس تمامًا عينات التربة. قم بعد ذلك بتعيين معرف عينة مع موقع جيد لكل أنبوب.
ملء 95 وصفت اثنين من أنابيب أجهزة الطرد المركزي ملليلتر مع عينة واحدة لكل أنبوب، حتى كل أنبوب هو نصف كامل تقريبا. ينبغي استخدام الأنبوب 96 كفراغ الاستخراج. ضع أنابيب العينة الفرعية على الجليد، وتسمية 96 معقم 200 ميكرولتر أنابيب PCR مسطحة مسطحة وفقا لتسميات جيدا لطبقة 96-جيدا، ثم ضع التسمية 200 أنابيب ميكرولتر في النظام في رف 96 جيدا.
لإعداد لوحة 96-well للتجربة، وإزالة الغطاء من لوحة ووضع الغطاء في كيس من البلاستيك العقيمة. ختم كيس لمنع التلوث وتغطية لوحة مع قطعة قبل قطع من ختم فيلم. ثم استخدام الأسطوانة المطاطية لتمسك بحزم الختم إلى لوحة وتخزين لوحة في أربع درجات مئوية.
لنقل العينات الفرعية إلى اللوحة، ضع 24 من أنابيب العينة الفرعية المليلتر في كتلة ثلج للتخزين البارد، واستخدم اسم العينة وورقة موقع البئر لتحديد الأنابيب المناسبة المناسبة البالغة 200 ميكرولتر مسطحة. دوامة العينات الفرعية واحدة في كل مرة، لمدة خمس ثوان لكل عينة لضمان التجانس وتحميل ما يقرب من 200 ميكرولترات من كل عينة في أنبوب PCR المناسب. عندما تم تحميل جميع العينات 24، استخدم مسح الورق المنقوع المبيض لتنظيف خارج أنبوب PCR واحد، وعكس والاستفادة من أنبوب على مقاعد البدلاء لنقل العينة إلى أعلى الأنبوب.
باستخدام الشعلة معقم ومبيض مقص مقطع الجزء السفلي من أنبوب PCR لإنشاء فتحة للعينة، وتمرير أنبوب على لوحة مع نهاية قطع التي تواجه حتى تم التوصل إلى البئر المناسبة. إمالة لوحة قليلا، لتسهيل ثقب فيلم ختم قبل قطع، ومع أنبوب مباشرة فوق البئر الصحيح، بسرعة ولكن عكس بعناية لوحة بحيث تلميح قطع يناسب في البئر. استخدام أداة تعقيم للاستفادة من الجزء العلوي من الأنبوب حتى كل من التربة قد سقطت من أنبوب في البئر.
وترك الأنبوب في البئر مع الرصاص مغلقة. عندما تم تحميل جميع العينات بنفس الطريقة، وإزالة واحدة 200 ميكرولتر مسطحة توج أنبوب PCR وإضافة 750 ميكرولترات من محلول حبة للعينة جيدا. وضع 200 ميكرولتر مسطحة توج PCR أنبوب مرة أخرى إلى البئر دفع كل الطريق إلى أسفل إلى البئر.
واستخدم شاربي لوضع علامة على الجزء العلوي من الأنبوب للإشارة إلى أنه تم تحميل البئر. عندما تم تحميل جميع الآبار مع الخرز إعادة الأنابيب عينة 24 إلى تخزين 20 درجة مئوية وإضافة 24 أنابيب جديدة دون عينة إلى كتلة الجليد، للسماح المجموعة التالية من العينات ليتم تحميلها في لوحة 96 جيدا كما أظهرت للتو. عندما تم تحميل جميع 95 من الآبار مع عينة والخرزة الحل، إضافة حل حبة فقط إلى البئر 96.
إزالة جميع الأنابيب، وتمرير لهم أكثر من الآبار المغطاة فقط وإزالة بعناية الفيلم قابلة للثقب من لوحة. ثم نقل بعناية غطاء لوحة من كيس من البلاستيك إلى لوحة ووضع لوحة في 20 درجة مئوية حتى استخراج المخطط لها. وتبين مقارنة طرق تحميل الألواح أن الطريقة المُثبتة تؤدي إلى أدنى تركيز للحمض النووي داخل الآبار الفارغة.
وباستخدام هذه الطريقة، كان تركيز الحمض النووي أقل بكثير عند استخدام الطريقة المقترحة من قبل ماكفرسون وآخرون. على الرغم من تركيز الحمض النووي بهذه الطريقة لم تكن مختلفة إحصائيا عن الطريقة الافتراضية qiagen. جميع الأساليب الثلاث، تنتج تركيزات الحمض النووي يعني تحت اثنين من نانوغرام لكل ميكرولتر.
على الرغم من أن هذه الطريقة الجديدة فقط تنتج الآبار مع عدم وجود تركيز الحمض النووي قابل للقياس. لتقليل احتمال تسرب، والحفاظ على أنبوب 200 ميكرولتر تستقيم عند تحريكه على لوحة، إمالة لوحة وإدراج أنبوب في البئر الصحيح.
