CUT & RUN هي تقنية قوية لتحديد توطين البروتين على الكروماتين ، وهنا نصف نسخة أحادية الخلية من هذه التقنية بتنسيق يدوي 96 بئرا. تتطلب معظم تقنيات توطين البروتين ، مثل ChIP-seq ، مدخلات عالية من الخلايا وتستغرق حوالي ثلاثة أيام لإكمالها. تم تحسين CUT & RUN ، بسبب الإشارة العالية والخلفية المنخفضة ، للتطبيق منخفض الخلية وخلية واحدة ، ويمكن إكماله في يوم واحد.
نحن نتصور أن هذه التقنية يمكن تطبيقها على أي عينة بيولوجية تقريبا ويمكن أن تكون قوية بشكل خاص لتحديد توطين العوامل في العينات النادرة ومنخفضة الوفرة ، مثل عينات المرضى الثمينة. قبل إجراء أي تجارب أحادية الخلية ، اختبر الجسم المضاد والتقنية على عدد كبير من الخلايا غير الثمينة. القيد الرئيسي لهذه التجربة هو الاعتماد على جسم مضاد قوي.
يوضح الإجراء سانتانا لاردو ، أخصائي أبحاث متمرس من مختبري. بعد فرز الخلايا المفردة وربط النوى بالخرز ، ضع الصفيحة المكونة من 96 بئرا على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا واسمح للخرز بالارتباط لمدة لا تقل عن خمس دقائق. ثم ، قم بإزالة وتجاهل supernatant.
أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع إلى الخرز المرتبط بالنواة ، واخلطه مع السحب اللطيف ، واحتضنه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع اللوحة على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا واسمح للجهاز الفائق بالتفريغ لمدة لا تقل عن خمس دقائق. ثم ، قم بإزالة وتجاهل supernatant دون إزعاج الخرز.
قم بإزالة اللوحة من الرف المغناطيسي وأعد تعليق الخرز في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل لكل تفاعل باستخدام السحب اللطيف. ضع اللوحة مرة أخرى على الرف المغناطيسي الذي يبلغ طوله 96 بئرا ، واسمح لل supernatant بالتنظيف ، ثم قم بإزالة السطح والتخلص منه. أعد تعليق الخرز في 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل لكل تفاعل باستخدام السحب اللطيف.
اصنع خليطا رئيسيا أوليا للأجسام المضادة عن طريق اقتباس 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل لكل تفاعل ثم أضف 0.5 ميكرولتر من الأجسام المضادة لكل تفاعل. أضف 25.5 ميكرولتر من المزيج العازل لغسول الأجسام المضادة ، متبوعا بسحب لطيف لكل عينة يتم معالجتها بجسم مضاد يستهدف البروتين محل الاهتمام. احتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
ثم ، ضع العينات مرة أخرى على الرف المغناطيسي الذي يبلغ طوله 96 بئرا. بمجرد أن يصبح السوبرناتانت واضحا ، قم بإزالته والتخلص منه دون إزعاج الخرز. بعد إزالة اللوحة من الرف المغناطيسي ، اغسل الخرز ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل وأعد تعليقه عن طريق السحب.
بعد وضع اللوحة مرة أخرى على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا والتخلص من supernatant كما هو موضح سابقا ، أعد تعليق كل عينة في 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل. اصنع خليط رئيسي من البروتين A MNase عن طريق إضافة 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل وكمية محسنة من البروتين A MNase لكل تفاعل. أضف 25 ميكرولتر من خليط البروتين A MNase الرئيسي إلى كل عينة، بما في ذلك عينات التحكم.
احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ضع اللوحة على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا. اسمح للسوبرناتانت بالتنظيف لمدة لا تقل عن خمس دقائق ثم قم بإزالة والتخلص من السوبرناتانت دون إزعاج الخرز.
بعد إزالة اللوحة من الرف المغناطيسي ، اغسل الخرز ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل وأعد تعليقه عن طريق السحب اللطيف. ضع اللوحة على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا وتخلص من السوبرناتانت كما هو موضح سابقا. ثم قم بإزالة العينات من الرف المغناطيسي وأعد تعليق الخرز في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل عن طريق السحب اللطيف.
قم بموازنة العينات إلى صفر درجة مئوية في خليط ماء مثلج لمدة خمس دقائق ثم قم بإزالة العينات من حمام الماء المثلج. أضف ميكرولتر واحد من كلوريد الكالسيوم 100 مللي مولا باستخدام ماصة متعددة القنوات. اخلطي جيدا ثلاث إلى خمس مرات باستخدام ماصة متعددة القنوات كبيرة الحجم ثم أعيدي العينات إلى صفر درجة مئوية.
ابدأ تشغيل مؤقت لمدة 10 دقائق بمجرد عودة اللوحة إلى حمام الماء المثلج. أوقف التفاعل عن طريق سحب 50 ميكرولتر من محلول يحتوي على ضعف تركيز RSTOP+، وقم بالتخزين المؤقت في كل بئر بنفس ترتيب إضافة كلوريد الكالسيوم. احتضان العينات لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
قم بتدوير الطبق عند 16،000 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. ضع اللوحة على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا. اسمح للسوبرنات بالمسح لمدة لا تقل عن خمس دقائق.
بعد ذلك ، انقل السوبرناتونات إلى طبق جديد من 96 بئرا وتخلص من الخرز. لاستخراج الحمض النووي ، أضف ميكرولتر واحد من 10٪ SDS و 0.83 ميكرولتر من 20 ملليغرام لكل ملليلتر بروتين K إلى كل عينة واخلط العينات عن طريق السحب اللطيف. احتضان العينات لمدة 10 دقائق عند 70 درجة مئوية.
أعد اللوحة إلى درجة حرارة الغرفة. أضف 46.6 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم الخماسي المولي و 90 ميكرولتر من 50٪ PEG4000 واخلطها عن طريق السحب اللطيف. أضف 33 ميكرولتر من حبات المغنطيسية البوليسترين إلى كل عينة واحتضنها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ضع اللوحة على رف مغناطيسي واسمح للطبقة الفائقة بالإزالة لمدة خمس دقائق تقريبا. ثم ، تخلص بعناية من supernatant دون إزعاج الخرز. شطف مرتين مع 150 ميكرولتر من 80 ٪ من الإيثانول دون إزعاج الخرز.
قم بتدوير اللوحة لفترة وجيزة عند 1000 مرة G لمدة 30 ثانية. ضع اللوحة مرة أخرى على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا وقم بإزالة جميع الإيثانول المتبقي دون إزعاج الخرز. جفف العينات بالهواء لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق.
أعد تعليق الخرز في 37.5 ميكرولتر من هيدروكلوريد TRIS 10 ملليمولار من الرقم الهيدروجيني 8 واحتضنه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع اللوحة مرة أخرى على رف مغناطيسي واترك الخرز يرتبط لمدة خمس دقائق. انقل 36.5 ميكرولتر من السوبرناتانت إلى طبق 96 بئر جديد متوافق مع الدراجة الحرارية وتخلص من الخرز.
بعد إجراء تقييم جودة الخلية ، تم فحص مظهر الخلية والنسبة المئوية ، مما يدل على أنه لا ينبغي استخدام الخلايا الجذعية الجنينية منخفضة الجودة. تم إجراء فرز خلية واحدة باستخدام صبغة Hoechst 33342 ، وتم حساب خلايا الاختبار لضمان وجود خلية صفر أو خلية واحدة في كل بئر. كشف تحليل هلام Agarose عن سلم وزن جزيئي منخفض ومكتبات uliCUT & RUN فردية أحادية الخلية.
يظهر تحليل المكتبة دون المستوى الأمثل والأمثل سلما منخفضا للوزن الجزيئي ، ومكتبة دون المستوى الأمثل بسبب هضم Mnase غير الفعال ، ومكتبة ناجحة مع عملية هضم مناسبة. يوضح توزيع محلل الأجزاء أن الحجم المتوقع للخلية الواحدة يتراوح من 150 إلى 500 زوج قاعدة. ومع ذلك ، في البروتينات الكبيرة ، سيكون للحمض النووي حوالي 270 زوجا أساسيا.
كشف إشغال البروتين باستخدام متصفح الجينوم أحادي الموضع الذي يصور عددا كبيرا من الخلايا أو التحكم السلبي و CTCF uliCUT & RUN أحادي الخلية أن الخلية الواحدة تمثل إلى حد كبير قمم قوية ، على غرار uliCUT & RUN عالي الخلية. كشفت الخرائط الحرارية ل CTCF أحادي الخلية أو التحكم السلبي عن نمط واضح من إثراء القراءة مباشرة عبر مواقع ربط CTCF الراسخة في الخلايا. تظهر الخرائط الحرارية أحادية البعد كثافة قراءة أعلى على مواقع ربط CTCF القائمة في مكتبات الخلية الواحدة بالنسبة للمناطق المحيطة وضوابط عدم وجود أجسام مضادة ، مما يدل على التخصيب الخاص بالأجسام المضادة في مواقع التجليد الثابتة.
من المهم موازنة النوى المرتبطة بالخرز في حمام الماء المثلج وعدم ارتفاع درجة حرارة العينة عند إضافة كلوريد الكالسيوم لمنع الإفراط في هضم الكروماتين.
