لم يكن أي من هذا ممكنا لولا دعم ناصر روسان. وأود أن أشكر H. دوغ موريس، دانييل دوناهو، وبريندا كلاونبرغ من مرفق التصوير الماوس NIH وبن أش من الضوئيات الصغيرة للتدريب والمناقشة المفيدة. كما أشكر منصورة نوروزي راد من زايس على مسح عينات البطن على زرادية 520 فيرسا. لورين سميث، سامانثا سميث، وراشيل نغ ساعدت أيضا في المسح الضوئي. مايك مارش من أنظمة أبحاث الأجسام قدم الدعم التقني اليعسوب. كما أنني ممتن للدعم المقدم من المعهد الوطني للقلب والرئة والدم (1K22HL137902-01) وصناديق البدء من جامعة وايومنغ. كما أشكر المراجعين المجهولين على اقتراحاتهم وتعليقاتهم المفيدة.

ولا يعلن صاحب البلاغ عن أي مصالح منافسة أو مالية.

ظل تصور Drosophila melanogaster سليما في جميع مراحل النمو تحديا ، ويرجع ذلك في المقام الأول إلى عدم توافق المجهر الخفيف مع بشرة سميكة مصطبغة موجودة في هذا الحيوان. في حين أن طرق التصوير الحيوانية الكاملة الأخرى ، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) ، والتصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT) ، والتنظير الفائق إلى جانب تطهير الأنسجة قد استخدمت بنجاح في الذباب50،51،52،53،54، μ CT يقدم عددا من المزايا التي تجعله مثاليا للتصوير الحيواني الكامل لهذا الكائن الحي13،15،30 . تخترق الأشعة السينية البشرة المصطبغة بسهولة ويسمح طول موجتها الصغير بالتصوير دون الميكرون. وضع العلامات يتطلب الحد الأدنى من الاستثمار في المواد الكيميائية المتاحة على نطاق واسع وليس المهارات مقاعد البدلاء المتخصصة13. كما تتوفر الماسحات الضوئية μ-CT تجاريا، والتكاليف مماثلة لمنصات المجهر الخفيف، في حين أنها أكثر جاذبية لمجموعة أوسع من التخصصات (الجيولوجيا وعلم الحفريات والهندسة، وما إلى ذلك) التي يمكن أن تستفيد أيضا من توافرها في مؤسسة ما. يمكن أيضا استخدام مصادر Synchrotron X-Ray للتصوير عالي الدقة μ CT للحشرات الثابتة والحية31و55و56، ولكنها أقل سهولة من الماسحات الضوئية التجارية على سطح المقعد.
يوفر هذا البروتوكول طريقة فعالة للحصول على صور μ CT للبالغين الذباب والجراء واليرقات والأجنة الخلوية. لاحظ أنه بالنسبة للعديد من الخطوات الموضحة أعلاه، يمكن أيضا تطبيق طرق بديلة لإعداد عينات للتصوير. وقد قدمت دراسات أخرى مقارنة مفصلة لمختلف التثبيت، ووضع العلامات، وتجفيف الخطوات لاستخدامها في الحشرات ويتم تشجيع المهتمين في اعتماد هذه التقنية لتقييم مزايا كل نهج1،4،13،29،30،57. وفي حين أن هذا البروتوكول بسيط نسبيا، فإن بعض الاقتراحات المفيدة تقدم.
أولا، ينبغي توخي الحذر عند تعطيل كندل العينات سليمة بحيث لا تتعطل الأنسجة الرخوة الكامنة بشكل كبير. من المهم السماح لليرقات والمراحل المبكرة من الجراء بالخضوع للتثبيت لمدة ساعتين في محلول بوين قبل الوخز. وهذا سوف تصلب الأنسجة والحد من كمية الهيموليم التي سوف تتسرب من ثقوب كتيكل، والتي يمكن أن تغير بنية الجهاز. يمكن فصل أجزاء الجسم الفردية (الرأس والصدر والبطن) للبالغين إذا كان الهيكل (الهياكل) ذات الاهتمام موجودا هناك. من المستحسن استخدام مشرط لشريحة نظيفة من خلال هذه الشرائح بدلا من سحبها بعيدا مع ملقط، والتي يمكن أن تعطل العمارة 3D من القناة الهضمية أو الجهاز العصبي المركزي، على سبيل المثال. أما بالنسبة للتوقيت، يحتاج البالغون عادة إلى 16 ساعة فقط. لتثبيت كامل، في حين أن مراحل اليرقات والجراء تحتاج إلى 24 ساعة. أيضا، إذا اليود أو تلطيخ PTA يبدو متفاوتا، يمكن وضع العينة مرة أخرى في الحل لاحتضان لفترة أطول حتى يتم تحقيق تلطيخ حتى. وأخيرا، لا ينبغي وضع عينات رطبة في 4 درجة مئوية، لأن هذا يبدو للحث على تشكيل فقاعات الهواء داخل تجويف الجسم بعد الاحترار لدرجة حرارة الغرفة.
ثانيا، سوف تختلف العينة المتصاعدة حسب الأداة ونوع المرحلة وما إذا كانت العينة تحتاج إلى البقاء رطبة أو تم تجفيفها في نقطة حرجة. إذا كان رطبا، تأكد من عدم تسرب العينة وربما تدمير الماسح الضوئي. عند تركيب العينة داخل طرف ماصة، تأكد من دفع بلطف مع كائن مملة حتى العينات يواجه مقاومة طفيفة ولا يمكن أن تتحرك. دفع من الصعب جدا يمكن أن يؤدي إلى تشوه لطيف والعيوب الهيكلية الكامنة. تأكد أيضا من محاذاة العينة في الحامل أقرب ما يمكن إلى محور الدوران. أي تمايل سيزيد من أوقات المسح الضوئي بسبب مجال الرؤية الأكبر ويقلل من دقة مخطط الكائنات المبرمج النهائي بعد إعادة الإعمار.
ثالثا، ستختلف إعدادات الماسح الضوئي للحصول على صور الإسقاط أيضا حسب الأداة. ولزيادة قدرات دقة الماسح الضوئي إلى أقصى حد، ينبغي أن يكون حجم بقعة شعاع الأشعة السينية صغيرا قدر الإمكان (5-10 ميكرومتر). ويمكن تحقيق ذلك من خلال تحقيق التوازن بين الجهد الأشعة السينية والإعدادات الحالية بحيث أن مجموع الطاقة هو 3-4 واط. مع هذه الإعدادات ووقت التعرض المناسب على الكاميرا ، يمكن تحقيق التوهين المناسب لأشعة X-ray بواسطة العينة والتباين الأمثل للصورة. يمكن استخدام مرشحات الألومنيوم أو النحاس بين الجسم ومصدر الأشعة السينية لضبط إعدادات الطاقة بالأشعة السينية المثلى للحصول على أفضل تباين للصورة أو توهين الشعاع بما يكفي لاستخدام المصادر التي تعمل بالطاقة العالية. أما بالنسبة لدقة الصورة، فإن هذا يعتمد على العديد من المتغيرات المختلفة، بما في ذلك نوع البقعة، وعدد صور الإسقاط، وحجم بيكسل الصورة، وموضع الكاميرا، وحركة العينة، واهتزازات الماسح الضوئي، ومعلمات إعادة البناء. يمكن أن يساعد شبح نمط الشريط (QRM GmbH) الذي يحتوي على علامات الحجم المعروفة في تقييم الدقة المكانية لإعداد ماسح ضوئي وكاميرا معينين.
ومن الجدير أيضا تقييم مزايا التصوير نقطة حرجة المجففة أو عينات رطب. قام Sombke وآخرون بتقييم مقارن للم طريقتين ووجدوا أن تجفيف النقاط الحرجة متفوق لتطبيقات μ CT التي تنطوي على المفصليات30. ومع ذلك، فإن فوائد العينات المائية هي أن الحيوانات تتعرض لتعرض أقل للمواد الكيميائية والميكانكية التي يمكن أن تؤدي إلى كل من التحف الكمية والمورفولوجية. هذا يميل أيضا إلى الحفاظ على الأنسجة الحساسة أفضل من CPD. ومع ذلك ، فإن العينات المائية لها عمر صلاحية أقصر بكثير ويجب تصويرها في موعد لا يتجاوز شهرا واحدا بعد التثبيت نظرا لأن تدهور الأنسجة وانخفاض جودة الصورة يصبحان واضحين في تلك المرحلة. أيضا، فإن القرار من عينات رطب يكون أقل قليلا من عينة المجففة نقطة حرجة، لأن الأشعة السينية يجب أن تخترق أيضا من خلال كل من طرف ماصة بلاستيكية والسائل المحيط بها (الماء أو العازلة). يمكن الحفاظ على عينات النقطة الحرجة المجففة لفترات أطول بكثير من الزمن ، خاصة عندما تبقى على Drierite. كما يمكن وضعها مباشرة في مسار شعاع الأشعة السينية ببساطة عن طريق لصق الأجنحة أو الساقين إلى دبوس حشرة ووضعه في مرحلة تشاك ، وتبسيط عملية التركيب. ومع ذلك ، فإن جفاف الإيثانول الواسع النطاق لهذه العينات يمكن أن يؤدي إلى انكماش الأنسجة وفقدان بنية الأنسجة الحساسة ، وهذا هو السبب في أنه من المهم إجراء مجموعة من تركيزات EtOH المتزايدة لتقليل هذه الآثار. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن جميع أشكال العلاج الكيميائي ، بما في ذلك تثبيت البارافورمالديهايد وحتى تلطيخ اليود يمكن أن يسبب انكماش الأنسجة58،59. في حين أن أيا من الأسلوبين لن توفر قياسات "حجم الجهاز الفعلي" في ذبابة حية ، فإن القياسات المورفومترية لا تزال صالحة عند مقارنة الحيوانات المتحولة والحيوانات البرية طالما يتم تنفيذ خطوات التثبيت والتلطيخ والتجفيف بشكل مماثل لكلا المجموعتين من العينات - ويفضل أن يكون ذلك بالتوازي.
في الختام، يوفر μ-CT أداة تصوير حيوانية كاملة مفيدة ل Drosophila33،34،35،36،37،38،39،40،41. وقد عرضت العديد من الدراسات الأخرى قوة هذه التكنولوجيا لفهم جوانب مختلفة من تصنيف الحشرات، والبيئة، وعلم وظائف الأعضاء، والتنمية، والتشريح التي يمكن أن تساعد في إثراء الدراسات المستقبلية في الذباب1،28،30،31،32،55،56،57 . جنبا إلى جنب مع الأدوات المجهرية الوراثية والخفيفة المستخدمة بالفعل على نطاق واسع في هذا الكائن الحي، يمكن μ CT وضع نفسها داخل خط أنابيب تجريبي يسمح بفهم أعمق بين النمط الجيني والنمط الظاهري.

أثبتت طرق التصوير التي تسمح بإجراء تحقيق مفصل في الهياكل الداخلية للجسم دون تدمير هندسته المعمارية ثلاثية الأبعاد بشكل عام أنها مفيدة على نطاق واسع لعدد من التخصصات المختلفة ، بما في ذلك الفيزياء والهندسة وعلوم المواد وعلم الآثار وعلم الحفريات والجيولوجيا والبيولوجيا1و2و 3 و4و5و6و7و9 . من بين طرق التصوير غير التدميرية هذه ، تعد المنصات القائمة على الأشعة السينية مفيدة بشكل خاص نظرا لقدرة الأشعة السينية عالية الطاقة على اختراق العديد من أنواع العينات والمواد المختلفة مع الحد الأدنى من التشتت مقارنة بموجات الضوء المرئية. التصوير المقطعي المحوسب (CT) ، والتصوير المقطعي microcomputed (μ CT) ، والتصوير المقطعي النانوي (نانو CT) ، والتصوير الدقيق السنكروترون ، لذلك ، ظهرت كتقنيات أساسية للتصوير بالأشعة السينية على أساس عينات تتراوح من متر إلى ميكرون ، مع قدرات دقة ملليمتر إلى دون ميكرون10،11،12،13،14.
في حين تختلف هذه المنصات في تصميمها وهندسة الأشعة السينية والمكونات من أجل تحقيق التوازن بين حجم العينة والدقة ، إلا أنها تعتمد جميعا على نفس المبدأ الأساسي لالتقاط الصور: مصدر للأشعة السينية التي تنتقل عبر الجسم ويتم التقاطها بواسطة كاشف. التوهين التفاضلي لشعاع الأشعة السينية أثناء مروره عبر كثافات مختلفة داخل الجسم يولد تباين الصورة. يتم الحصول على البيانات ثلاثية الأبعاد عن طريق تدوير العينة أو الكاشف ، وجمع سلسلة من صور الإسقاط 2D التي يتم إعادة بنائها بعد ذلك باستخدام الخوارزميات في مخططات تحتوي على معلومات ثلاثية الأبعاد تكون دقتها متساوية في x،y،z15. بالنسبة للعديد من الماسحات الضوئية μ CT التي تستخدم هندسة الأشعة السينية ذات الحزمة المخروطية لإسقاط الأشعة السينية في الكائن الذي يتم تصويره ، يتم استخدام خوارزمية Feldkamp لإعادة بناء الكائن بدقة مع الحد الأدنى من الأخطاء16.
يتم تحديد دقة منصة معينة في المقام الأول من خلال معلمات النظام مثل حجم شعاع الأشعة السينية (حجم البقعة) ، وهندسة الماسح الضوئي (المسافة من الكائن إلى مصدر الأشعة السينية) ، وحجم البكسل على الكاشف ، وخوارزميات إعادة البناء المستخدمة. عوامل إضافية، مثل اهتزازات الماسح الضوئي، وتقلبات شعاع الأشعة السينية، وحركة العينة، ونوع المادة أو وصمة عار الكيميائية المستخدمة لتصور الكائن يمكن أن تؤثر أيضا بشكل كبير على القرار المكاني تحت condidtions التصوير في العالم الحقيقي15.
بالنسبة للتطبيقات الطبية الحيوية ، لعبت CT و μ CT دورا رئيسيا في تعزيز فهمنا لآليات التشريح وعلم وظائف الأعضاء والتنمية والمرض ، حيث كانت بمثابة أداة لتشخيص المريض البشري كمنصة تصوير ما قبل السريرية للكائنات الحية النموذجية17،18. على سبيل المثال ، فإن اتحاد ماوس الدولي للفينوتيبينج ، الذي يهدف إلى تحديد وظيفة كل جين في جينوم الماوس ، يستخدم μ CT كجزء من خط أنابيب phenotyping19. وكانت نتائجها حاسمة لفهم الجينات المشاركة في عمليات التنمية والمرض، في حين تعمل أيضا كأطلس لتشريح الفئران والتنمية20. الكائنات الحية نموذج آخر، مثل حمار وحشي والجرذان، كما احتضنت تماما استخدام μ CT لأداء phenotyping الحيوان كله من عدد من المسوخ الجينات17،21،22،23.
ميزة الجمع بين التصوير الحيواني كله مع الكائنات الحية النموذجية هو أن الفهم الآلي لوظيفة الجينات لعملية بيولوجية معينة يمكن استكشافها بالكامل. وهذا ممكن بسبب الجينوم المميز والعديد من الأدوات الجينية المتاحة في الكائنات الحية النموذجية التي تسمح بالتلاعب الدقيق بوظيفة الجينات في نقاط زمنية تنموية متميزة، وأنسجة محددة، وخلايا فردية، وحتى العضيات دون الخلوية. وتشمل هذه أنظمة التعبير الثنائي مثل نظام UAS /GAL4 (ومشتقاته العديدة) ، CRISPR / Cas9 ، وRNAi24،25،26. عندما يتم استخدام هذه الأدوات الوراثية جنبا إلى جنب مع خط أنابيب التصوير قوية تتكون من المجهر الإلكتروني، المجهر الخفيف (الفلورسنت وغير الفلورية)، والتصوير الحيواني كله مثل μ CT، يمكن تحقيق تقييم شامل للجزيئات والخلايا والأنسجة والأعضاء، والكائن الحي بأكمله، مما يسمح لفهم أعمق بكثير من وظيفة الجينات.
هذا البروتوكول يركز على استخدام μ CT في الكائن الحي نموذج غير الثدييات Drosophila melanogaster، الذي ساعد عدد لا يحصى من الأدوات الوراثية توضيح العديد من الآليات الجزيئية26،27. تم تبنيه من البروتوكولات السابقة في الحشرات غير النموذجية1،28،29،30،31،32، ويبني من دراسات μ CT السابقة في Drosophila لوضع بروتوكول موحد لاستخدامه في هذا الحيوان33،34،35،36،37،38،39 ,40,41. وترد الخطوط العريضة للخطوات اللازمة لنجاح إعداد العينات وتصويرها وتحليلها لمجموعات بيانات μ-CT التي تستخدم الماسحات الضوئية المتاحة تجاريا. مع هذا البروتوكول ، يمكن تصور جميع مراحل النمو من ذبابة في قرار عالية لكل من الوصفية والفرضية اختبار الدراسات ، بما في ذلك التصنيف والتشريح والتنمية وعلم وظائف الأعضاء ، والمرض27. سيكون هذا البروتوكول مفيدا أيضا لتصوير أي حشرة تقريبا وحتى المواد غير الحية التي تتطلب تلطيخا كيميائيا لتباين الصورة لتعزيز التصور من خلال μ CT.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For critical point drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#39;s Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT10132</td>
			<td>For animal fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dragonfly Software</td>
			<td>Object Research Systems</td>
			<td></td>
			<td>For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For microfuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine Solution (I2KI)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SI86-1</td>
			<td>For staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcomputed Tomography Scanner</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Skyscan 1172</td>
			<td>Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 &#181;m pixel size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcomputed Tomography Scanner Software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-15</td>
			<td>For poking hole in cuticle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRecon Image Reconstruction Software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipet tips</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-120</td>
			<td>Sample mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Resarch Products International</td>
			<td>P32060-4000.0</td>
			<td>Dilute to 1X with water before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic Acid Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79690-25g</td>
			<td>For staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26018-17</td>
			<td>For Minutien Pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>111036</td>
			<td>To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Ray Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Xradia 520 Versa</td>
			<td>Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD&#8482;)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole animal imaging of drosophila melanogaster using microcomputed tomography

تسمح أدوات التصوير الطبي الحيوي بالتحقيق في الآليات الجزيئية عبر المقاييس المكانية ، من الجينات إلى الكائنات الحية. وقد استفادت Drosophila melanogaster ، وهو كائن نموذجي يتميز بشكل جيد ، من استخدام المجهر الضوئي والإلكترون لفهم وظيفة الجينات على مستوى الخلايا والأنسجة. إن تطبيق منصات التصوير التي تسمح بفهم وظيفة الجينات على مستوى الكائن الحي السليم بأكمله من شأنه أن يزيد من تعزيز معرفتنا بالآليات الجينية. هنا يتم تقديم طريقة تصوير حيواني كاملة توضح الخطوات اللازمة لتصور Drosophila في أي مرحلة تنموية باستخدام التصوير المقطعي المجهري (μ CT). وتشمل مزايا μ-CT الأجهزة المتاحة تجاريا والحد الأدنى من الوقت العملي لإنتاج معلومات دقيقة ثلاثية الأبعاد بدقة على مستوى ميكرون دون الحاجة إلى طرق تشريح الأنسجة أو تطهيرها. يمكن إقرانها مع البرامج التي تسرع تحليل الصور وتقديم 3D ، وتحليل مورفوميتري مفصلة من أي نظام الأنسجة أو الجهاز لفهم أفضل لآليات التنمية وعلم وظائف الأعضاء ، والتشريح لكل من الوصفية والفرضية اختبار الدراسات. من خلال استخدام سير عمل التصوير الذي يتضمن استخدام المجهر الإلكتروني ، المجهر الخفيف ، μ CT ، يمكن إجراء تقييم شامل لوظيفة الجينات ، وبالتالي تعزيز فائدة هذا الكائن الحي النموذجي القوي.

ويبين الشكل 2 صورا لجنين، و3 يرقاتنجمية، وجراء في مرحلة البلوغ الفراتية (P7)، وذبابة أنثى بالغة ملطخة باليود ومصورة رطبة في الماء باستخدام ماسح ضوئي تجاري على سطح المقعد. الحفاظ الممتاز وحتى تلطيخ الأنسجة الحساسة واضحة ، مما يسمح بتحديد جميع الأعضاء الرئيسية بسهولة واستخدامها للتحليل المورفومتري والتصور ثلاثي الأبعاد.
عادة، توفر عمليات المسح التي تكتسب صورا إسقاط أقل للعينة دقة أقل من عمليات المسح التي تكتسب المزيد من صور الإسقاط، مع المفاضلة التي تقضيها في المسح الضوئي. على الرغم من أن أوقات المسح الضوئي ستختلف حسب الأداة ومعلمات المسح الضوئي الأخرى ، إلا أن عمليات المسح التي تكتسب بضع مئات من الإسقاطات (~ 3 ميكرومتر حجم بكسل الصورة) تستغرق حوالي 30 دقيقة لكل عينة ، في حين أن المسح الضوئي الذي يتكون من آلاف صور الإسقاط (700 نانومتر - 1.25 ميكرومتر حجم بكسل الصورة) يمكن أن يستغرق 8-16 ساعة. تظهر مقارنة من نفس الرأس يطير الكبار التي اتخذت في كل من 'بطيئة' (الآلاف من التوقعات) و 'سريع' (مئات من التوقعات) وضع المسح الضوئي في الشكل 3. الأهم من ذلك ، لا تختلف التحليلات المورفومترية بين المسح "البطيء" و "السريع" (الشكل 3C)40. لذلك، يستخدم خط أنابيب التصوير لدينا مسحا سريعا لتوليد حجم عينة كبير بما يكفي للتحليل المورفوميتري، وفحوصات بطيئة لتصور أي عيوب مورفولوجية أو تشريحية بدقة أعلى. باستخدام البرنامج (الخطوة 7) ، يمكن تقسيم أي نظام الأنسجة أو الجهاز من الفائدة واستخدامها لتحليل morphometric وتصور في 3D باستخدام صانع الفيلم(فيلم 1).
يظهر الشكل 4 مثالا على بطن الذبابة الملطخة ب PTA والمطبطبة المصورة (الماء) أو بعد تجفيف النقطة الحرجة (CPD) على مجهر الأشعة السينية (جدول المواد). التفاصيل التي يوفرها مزيج من منطقة التجارة التفضيلية وقدرات هذه المنصة واضحة بسهولة في هذه الصور ، بحيث يتم حل خلايا الظهارة الفردية لحزم midgut والحيوانات المنوية داخل الخصيتين بسهولة. في حين أن صورة CPD تظهر زيادة طفيفة في الدقة مقارنة بالعينة المائية ، يتم تحقيق الحفاظ بشكل أفضل على البنية الفائقة للأنسجة الحساسة (مثل الخلايا الدهنية بالقرب من البشرة) مع عينات رطبة(Movie 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig01.jpg"> الشكل 1: نظرة عامة على تصميم الماسح الضوئي وتركيب العينة μ CT. (أ) ماسح ضوئي تجاري μ-CT. (ب) عرض داخل الماسح الضوئي. يصدر مصدر الأشعة السينية (إلى اليمين) أشعة سينية تمر عبر العينة الموجودة على مرحلة دوارة (سهم أصفر). إن توهين هذه الأشعة السينية يولد تباينا في الصورة أثناء مرورها عبر العينة وعلى الكاشف، الذي يتكون من شاشة تلألؤ تحول الأشعة السينية إلى فوتونات وكاميرا CCD قياسية (يسار). (ج) تركيب ذبابة فاكهة الكبار للتصوير رطب في الماء. يتم لف نقاط الاتصال بين طرف ماصة وحامل النحاس في فيلم البارافين لمنع التسرب والأضرار المحتملة للماسح الضوئي. يتم تسليط الضوء أيضا على تشاك المرحلة. لاحظ أن طرف ماصة تم وضعه قليلا خارج المحور، مما أدى إلى وقت أطول المسح الضوئي وانخفاض القرار في إعادة الإعمار النهائي. (D) صورة إسقاط 2D واحدة من ذبابة أنثى بالغة؛ يتم الحصول على مئات إلى آلاف من هذه التوقعات أثناء المسح الضوئي على طول محور الدوران وتستخدم لإعادة الإعمار لتوليد توموجرامات تحتوي على دقة متساوية الخواص ومعلومات ثلاثية الأبعاد دقيقة. أشرطة المقياس (C) = 2 مم P، الخلفية؛ V، فينترال. وقد تم تعديل هذا الرقم من شوبورغوآخرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig02.jpg"> الشكل 2: جميع مراحل دورة حياة دروسوفيليا ميلانوغاستر، التي تم تصويرها بواسطة μ-CT. عينات ملطخة باليود وصور رطبة في الماء. يظهر هو شريحة واحدة 2D. أ)جنين أكمل المراحل المبكرة من الاختراق (النجمة). (ب) يرقة نجمة ثالثة. (ج)A P7 فارات الكبار أثناء التحول. (د)أنثى بالغة. ويسلط الضوء على مختلف الأجهزة: BWM, عضلات جدار الجسم; Br, الدماغ; القرص المضغوط، كارديا؛ Cr, محصول; DLMs, العضلات الطولية الظهرية; DVM, عضلات البطن الظهري; E-AD، قرص هوائي العين؛ إم, جنين; FB, أجسام الدهون; FBCs, خلايا الجسم الدهنية; H, قلب; HG, هندغوت; لا، لامينا؛ L, ساق; مغ, ميدغوت; OL, الفص البصري الدماغ; أوف، أوفيبوستور؛ PC، كتل الجراء؛ SG, الغدد اللعابية; VNC, سلك العصب البطني; W, جناح; WD، قرص الجناح. أشرطة المقياس (A) = 100 ميكرومتر؛ (B)-(D) = 500 ميكرومتر. A, الأمامي; L، إلى اليسار. معلمات المسح الضوئي: مصدر إلى عينة المسافة (مم): (A، D) 36.5، (B) 48.8، (C) 40.3. مصدر إلى مسافة الكاميرا (مم): (A، D) 350، (B، C) 285. حجم بكسل الكاميرا (μm): (A-D) 11.6. حجم بيكسل الصورة (μm): (A، D) 1.2، (B) 1.9، (C) 1.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig03.jpg"> الشكل 3: لا تغير معلمات المسح الضوئي ودقة الصورة التحليلات المورفومترية. يتم مسح رأس شخص بالغ باستخدام إعدادات الماسح الضوئي(A و A)و (مئات الإسقاطات) و(B، B') إعدادات الماسح الضوئي "البطيئة" (آلاف الإسقاطات). الدماغ مبين باللون الأصفر. (ج) قياسات حجم الدماغ من المسح البطيء والسريع. أبرز الهياكل: AL; فص هوائي؛ CB, الدماغ المركزي; FB, مروحة على شكل الجسم; FCs, الخلايا الدهنية; لا، لامينا؛ لو، لوبولا؛ لوب، لوحة لوبولا. لي، medulla؛ إعادة، شبكية العين. ن = 5 ، ويلش تي الاختبار. ns = غير هام. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. معلمات المسح الضوئي: مصدر إلى عينة المسافة (مم): (أ) 44.4، (ب) 36.5. المصدر إلى مسافة الكاميرا (مم): (أ) 348 (ب) 350. حجم بكسل الكاميرا (μm): (A-B) 11.6. حجم بيكسل الصورة (μm): (A) 2.95، (B) 1.2. وقد تم تعديل هذا الرقم من شوبورغوآخرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig04.jpg"> الشكل 4: Drosophila الميلانوغاستر البطن المصورة بواسطة المجهر بالأشعة السينية. كانت البطن ملطخة بنسبة 0.5٪ من PTA وصورت رطبة (ماء) أو بعد تجفيف النقاط الحرجة (CPD). (أ) نقطة حرجة المجففة البطن، هو مبين من منظور YZ و (A') XZ المنظور. (ب) البطن رطب، يظهر من منظور YZ و (B') XZ المنظور. يتم تسليط الضوء على مختلف الأجهزة: FC, الخلايا الدهنية; HG, هندغوت; مغ, ميدجوت; SP, مضخة الحيوانات المنوية; تي، الخصيتين. أشرطة المقياس (A) = 250 ميكرومتر D، دورسال؛ A, الأمامي; L، إلى اليسار. معلمات المسح الضوئي: مصدر إلى عينة المسافة (مم): (أ) 6.7، (ب) 7. المصدر إلى مسافة الكاميرا (مم): (أ) 28 (ب) 29.5. الهدف: (A-B) 4X. حجم بكسل الصورة (μm): (A-B) 0.65. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
فيلم 1: يرقة نجمة ثالثة ، قدمت في 3D باستخدام صانع الفيلم في اليعسوب. وتشمل الأجهزة البارزة الدماغ (الأصفر) وأقراص العين الهوائية التصويرية (الأحمر) والجسم الدهني (الأزرق) وعضلات جدار الجسم (الخضراء). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61515/Movie_1_Revised.avi" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.</a>
الفيلم 2: مقارنة العينات المصورة في الماء أو اتبع التجفيف نقطة حرجة. تظهر البطن ملطخة 0.5٪ PTA. تم مسح كلا البطنين بإعدادات حجم بكسل صورة متطابقة (0.65 ميكرومتر). تظهر سلسلة من الشرائح ثنائية الأبعاد في شكل "Z-stack" (YZ) بدءا من السطح الظهري وانتهاء على السطح البطني للبطن. أبرز الأجهزة: FC, الخلايا الدهنية; مغ, ميدجوت; SP, مضخة الحيوانات المنوية; تي، الخصيتين. معلمات المسح الضوئي: مصدر إلى عينة المسافة (مم): (أ) 6.7، (ب) 7. المصدر إلى مسافة الكاميرا (مم): (أ) 28 (ب) 29.5. الهدف: (A-B) 4X. حجم بكسل الصورة (μm): (A-B) 0.65. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61515/Movie_2_Revised.avi" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography at JoVE.com

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

يتم تقديم بروتوكول يسمح بتصور Drosophila melanogaster سليمة في أي مرحلة من مراحل التطوير باستخدام التصوير المقطعي microcomputed.

التصوير الحيواني كله من الميلانوغاستر Drosophila باستخدام التصوير المقطعي microcomputed

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

whole-animal-imaging-drosophila-melanogaster-using-microcomputed

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

4.8K Views.  University of Wyoming. يتم تقديم بروتوكول يسمح بتصور Drosophila melanogaster سليمة في أي مرحلة من مراحل التطوير باستخدام التصوير المقطعي microcomputed.

Video: Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

التصوير تستقيم من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; غرف البيض

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

يعاير بالسكان خلية الدم لل<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em&gt; اليرقة

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

تربية ذبابة الفاكهة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تحت ممحوضة ومعروف المعايشات شروط

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. This morphological alteration is also recognized as epithelial to mesenchymal transition (EMT). Dysregulation of EMT is associated with fibrosis and cancer metastasis. There is emerging evidence that EMT is controlled by a number of molecular mechanisms. As such, many key genes that control apical constriction are also known to be important factors in the EMT observed in cancer metastasis. Like EMT during Drosophila gastrulation, epithelial cells can be induced to change their shape and be reprogrammed to redirect cell fate towards various other cell types. Here we provide a robust imaging method of Drosophila gastrulation to assay the initiation of morphogenetic cellular movements and cell fate identification during this stage of embryonic development. Using this method, we identify cell rearrangement at the time of gastrulation and demonstrate the importance of apical constriction during gastrulation using GFP labeled DE-cadherin.

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Herein we describe a procedure to capture live images of Drosophila gastrulation. This has enabled us to better understand the apical constriction involved in early development and further analyze mechanisms governing cellular movements during tissue structure modification.

التصوير من التعديلات خلية الشكل والحركة الخلية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; المعيدة عن طريق DE-كادهيرين مراسل الذباب المعدلة وراثيا

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

ذوبان الجليد واستزراع كريوبريسيرفينج خطوط الخلايا المورفولوجية

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

طرق لاختبار اضطراب الغدد الصماء في الميلانوجاستر Drosophila

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

فحص لسلامة حاجز الدم في الدماغ في دروسوفيلا melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ribonucleoprotein particle movement, mRNA localization, organelle movement, and cytoskeletal dynamics. There are several methods for live imaging that have been developed. Due to the fact that each method involves dissecting individual ovarioles placed in media or halocarbon oil, cellular damage due to hypoxia and/or physical manipulation will inevitably occur over time. One downstream effect of hypoxia is to increase oxidative damage in the cells. The purpose of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries after induction of controlled cellular damage. Here, we use hydrogen peroxide to induce cellular oxidative damage and give examples of the effects of such damage on two subcellular structures, mitochondria and Clu bliss particles. However, this method is applicable to any subcellular structure. The limitations are that hydrogen peroxide can only be added to aqueous media and would not work for imaging that uses halocarbon oil. The advantages are that hydrogen peroxide is readily available and inexpensive, acts quickly, its concentrations can be modulated, and oxidative damage is a good approximation of damage caused by hypoxia as well as general tissue damage due to manipulation.

The objective of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries.

تصور آثار الضرر التأسدي على غرف البيض Drosophila باستخدام التصوير الحي

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged molecules within complex biological samples. While traditional confocal microscopes allow one to resolve two adjacent fluorescent point sources located a few hundred nanometers apart, observing the finer details of subcellular biology requires the ability to resolve signals in the order of tens of nanometers. Numerous hardware-based methods for super-resolution microscopy have been developed to allow researchers to sidestep such resolution limits, although these methods require specialized microscopes that are not available to all researchers. An alternative method for increasing resolving power is to isotropically enlarge the sample itself through a process known as expansion microscopy (ExM), which was first described by the Boyden group in 2015. ExM is not a type of microscopy per se but is rather a method for swelling a sample while preserving the relative spatial organization of its constituent molecules. The expanded sample can then be observed at an effectively increased resolution using a traditional confocal microscope. Here, we describe a protocol for implementing ExM in whole-mount Drosophila embryos, which is used to examine the localization of Par-3, myosin II, and mitochondria within the surface epithelial cells. This protocol yields an approximately four-fold increase in sample size, allowing for the detection of subcellular details that are not visible with conventional confocal microscopy. As proof of principle, an anti-GFP antibody is used to distinguish distinct pools of myosin-GFP between adjacent cell cortices, and fluorescently labeled streptavidin is used to detect endogenous biotinylated molecules to reveal the fine details of the mitochondrial network architecture. This protocol utilizes common antibodies and reagents for fluorescence labeling, and it should be compatible with many existing immunofluorescence protocols.

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Here, a protocol for the implementation of expansion microscopy in early Drosophila embryos to achieve super-resolution imaging using a conventional laser-scanning confocal microscope is presented.

استخدام الفحص المجهري التوسعي لتكبير أجنة ذبابة الفاكهة المثبتة بالكامل جسديا للحصول على تصوير فائق الدقة

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...

تصوير نبتات الدماغ الحية من ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر يرقات Instar الثالثة

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

تسليط الضوء على المؤلف: التحقيق في ديناميكيات انقسام الخلايا غير المتماثلة: بروتوكول للتصوير الحي لنباتات دماغ يرقات ذبابة الفاكهة 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

تصوير الخلايا الحية لذبابة الفاكهة الميلانوجاستر أدمغة اليرقات الثالثة

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...