כל זה לא היה אפשרי ללא תמיכתו של נאצר רוסאן. אני רוצה להודות לדאג מוריס, דניאל דונהיו וברנדה קלונברג ממתקן הדמיית העכברים של NIH ובן אצ'ה ממיקרו פוטוניקס על האימונים והדיון המועיל. אני גם מודה למנסורה נורוזי ראד מזאייס על סריקת דגימות בטן בקסרדיה 520 ורסה. גם לורן סמית', סמנתה סמית ורייצ'ל אנג עזרו בסריקה. מייק מארש ממערכות מחקר אובייקטים סיפק תמיכה טכנית שפירית. אני גם אסיר תודה על התמיכה של מכון הלב, הריאות והדם הלאומי (1K22HL137902-01) וקרנות סטארט אפ מאוניברסיטת ויומינג. אני גם מודה לסוקרים האנונימיים על ההצעות וההערות המועילות שלהם.

המחבר אינו מצהיר על אינטרסים מתחרים או פיננסיים.

הדמיית Drosophila melanogaster שלם בכל השלבים ההתפתחותיים נותרה אתגר, בעיקר בשל חוסר תאימות של מיקרוסקופיה אור עם עבה, פיגמנט חותך נמצא בחיה זו. בעוד שיטות הדמיה של בעלי חיים שלמים אחרות, כגון הדמיית תהודה מגנטית (MRI), טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) ו ultramicroscopy בשילוב עם ניקוי רקמות שימשו בהצלחה זבובים50,51,52,53,54, μ-CT מציג מספר יתרונות שהופכים אותו אידיאלי עבור הדמיה חיה שלמה של אורגניזם זה13,15,30 . צילומי רנטגן חודרים בקלות את החתך הפיגמנטי ואורך הגל הקטן שלהם מאפשר הדמיה תת-מיקרונית. תיוג דורש השקעה מינימלית בכימיקלים זמינים נרחבים וללא כישורי ספסל מיוחדים13. סורקי μ-CT זמינים גם הם מסחרית, והעלויות דומות לפלטפורמות מיקרוסקופיות קלות, ובמקביל אטרקטיביות יותר למגוון רחב יותר של דיסציפלינות (גיאולוגיה, פליאונטולוגיה, הנדסה וכו ') שיכולות גם ליהנות לזמינותה במוסד. ניתן להשתמש במקורות רנטגן סינכרוטרון גם להדמיית μ-CT ברזולוציה גבוהה של חרקים קבועים וחיים31,55,56, אך הם נגישים פחות מסורקים מסחריים.
פרוטוקול זה מספק דרך יעילה להשיג תמונות μ-CT של מבוגרים מעופפים, גלמים, זחלים ועוברים תאיים. שים לב כי עבור רבים מהצעדים המתוארים לעיל, ניתן להחיל שיטות חלופיות גם כדי להכין דוגמאות להדמיה. מחקרים אחרים סיפקו השוואה מפורטת של של שלבי קיבעון, תיוג וייבוש שונים לשימוש בחרקים ואלה המעוניינים לאמץ טכניקה זו מוזמניםלהעריךאת היתרונות של כל גישה 1,4,13,29,30,57. בעוד פרוטוקול זה הוא פשוט יחסית, כמה הצעות מועילות מוצגות.
ראשית, יש לנקוט זהירות בעת שיבוש חתך של דגימות שלמות, כך שבבית רקמות רכות אינן משובשות באופן משמעותי. חשוב לתת לשלבי זחלים ופופאלים מוקדמים לעבור קיבעון במשך שעתיים בפתרון של בוין לפני לחטט. זה יקשיח את הרקמה ויגביל את כמות המולימפ כי יהיה למטלג מתוך חורי נקב, אשר יכול לשנות את ארכיטקטורת האיברים. מקטעי גוף בודדים (ראש, בית חזה ובטן) של המבוגר ניתן להפריד אם המבנה של עניין ממוקמים שם. מומלץ להשתמש באזמל כדי לחתוך בצורה נקייה את המקטעים האלה במקום להפריד אותם עם מלקחיים, אשר יכול לשבש את הארכיטקטורה 3D של המעיים או מערכת העצבים המרכזית, למשל. באשר לתזמון, מבוגרים בדרך כלל צריכים רק 16 שעות. עבור קיבוע מלא, בעוד שלבים זחל וגופל צריך 24 שעות. כמו כן, אם כתמי יוד או PTA נראה לא אחיד, המדגם יכול להיות ממוקם בחזרה בתמיסה לדגור זמן רב יותר עד אפילו כתמים מושגת. לבסוף, דגימות hydrated לא צריך להיות ממוקם ב 4 °C (50 °F), כמו זה נראה לגרום להיווצרות של בועות אוויר בתוך חלל הגוף לאחר התחממות לטמפרטורת החדר.
שנית, הרכבה מדגם ישתנה לפי מכשיר, סוג שלב והאם המדגם צריך להישאר hydrated או כבר נקודה קריטית מיובשת. אם hydrated, להבטיח את המדגם לא לדלוף ואולי להרוס את הסורק. בעת הרכבת הדגימה בתוך קצה פיפטה, הקפידו לדחוף בעדינות עם חפץ קהה עד שהדגימות נתקלות בהתנגדות קלה ולא יכולות לזוז. לחיצה קשה מדי עלולה להוביל לעיוות בקצרה ולפגמים מבניים. כמו כן, ודא כי המדגם מיושר במחזיק קרוב ככל האפשר לציר הסיבוב. כל תנודה תגדיל את זמני הסריקה בשל שדה הראייה הגדול יותר ותפחית את הרזולוציה של טומוגרמה הסופית לאחר השחזור.
שלישית, הגדרות הסורק לרכישת תמונות הקרנה ישתנו גם הן לפי מכשיר. כדי למקסם את יכולות הרזולוציה של הסורק, גודל ספוט קרן הרנטגן צריך להיות קטן ככל האפשר (5-10 מיקרומטר). ניתן להשיג זאת על ידי איזון מתח רנטגן והגדרות זרם, כך שההספק הכולל הוא 3-4 W. עם הגדרות אלה וזמן החשיפה המתאים במצלמה, ניתן להשיג חיווי נכון של קרן הרנטגן על ידי הדגימה וניגודיות תמונה אופטימלית. השימוש במסנני אלומיניום או נחושת בין האובייקט למקור הרנטגן יכול לשמש לכוונון הגדרות אנרגיית הרנטגן האופטימליות לניגודיות התמונה הטובה ביותר או להחלשת הקרן מספיק כדי להשתמש במקורות בעלי עוצמה גבוהה יותר. באשר לרזולוציית התמונה, הדבר יהיה תלוי במשתנים רבים ושונים, כולל סוג כתם, מספר תמונות הקרנה, גודל פיקסל תמונה, מיקום המצלמה, תנועת הדגימה, תנודות הסורק ופרמטרים של שחזור. פנטום תבנית סרגל (QRM GmbH) המכיל סמני גודל ידועים יכול לסייע בהערכת רזולוציה מרחבית עבור הגדרת סורק ומצלמה נתונה.
כדאי גם להעריך את היתרונות של הדמיה נקודה קריטית מיובש או hydrated דגימות. Sombke ואח ' ביצע הערכה השוואתית של שתי השיטות ומצא ייבוש נקודה קריטית להיות מעולה עבור יישומי μ-CT מעורבים פרוקי רגליים30. עם זאת, היתרונות של דגימות hydrated הם כי בעלי חיים חשופים פחות חשיפה כימית ומכאנית שיכול להוביל הן כמותי ומורפולוגית. זה גם נוטה לשמר רקמות עדינות טוב יותר מאשר CPD. עם זאת, דגימות hydrated יש חיי מדף קצרים בהרבה צריך להיות התמונה לא יאוחר מחודש לאחר קיבעון מאז השפלת רקמות ואיכות תמונה מופחתת הופך ברור בשלב זה. כמו כן, הרזולוציה של דגימות hydrated יהיה קצת פחות מדגם מיובש נקודה קריטית, כי צילומי רנטגן חייבים לחדור גם דרך קצה פיפטה פלסטיק ואת הנוזל שמסביב (מים או חוצץ). דגימות מיובשות נקודה קריטית ניתן לשמר במשך פרקי זמן ארוכים בהרבה, במיוחד כאשר נשמר על Drierite. הם גם יכולים להיות ממוקמים ישירות בנתיב קרן הרנטגן פשוט על ידי הדבקת הכנפיים או הרגליים סיכת חרקים והצבתו על צ'אק הבמה, פישוט תהליך ההרכבה. עם זאת, התייבשות האתנול הנרחבת של דגימות אלה יכולה להוביל להתכווצות רקמות ואובדן ארכיטקטורת רקמות עדינה, ולכן חשוב לבצע מגוון של ריכוזי EtOH גוברים כדי למזער את ההשפעות האלה. עם זאת, יש לציין כי כל צורות הטיפול הכימי, כולל קיבעון paraformaldehyde ואפילו כתמי יוד יכול לגרום התכווצותרקמות 58,59. אף על פי שאף אחת מהשיטות לא תספק מדידות של 'גודל איברים בפועל' בזבוב חי, מדידות מורפוטיות עדיין תקפות בעת השוואת בעלי חיים מוטנטיים וטיפוסי בר כל עוד שלבי הקיבעון, הכתמים והייבוש מתבצעים באופן זהה עבור שתי קבוצות הדגימות – רצוי במקביל.
לסיכום, μ-CT מספק כלי הדמיה בעל חיים שלם שימושי עבור Drosophila33,34,35,36,37,38,39,40,41. מחקרים רבים אחרים הציגו את כוחה של טכנולוגיה זו להבנת היבטים שונים של טקסונומיה חרקים, אקולוגיה, פיזיולוגיה, פיתוח ואנטומיה שיכולים לעזור ליידע מחקרים עתידיים זבובים1,28,30,31,32,55,56,57 . בשילוב עם כלי מיקרוסקופיה גנטית ואור כבר בשימוש נרחב באורגניזם זה, μ-CT יכול למקם את עצמו בתוך צינור ניסיוני המאפשר הבנה עמוקה יותר בין גנוטיפ פנוטיפ.

שיטות הדמיה המאפשרות חקירה מפורטת של מבנים פנימיים של אובייקט מבלי להרוס את הארכיטקטורה התת-ממדית הכוללת שלו הוכיחו את עצמם כמועילות באופן נרחב למספר דיסציפלינות שונות, כולל פיזיקה, הנדסה, מדע החומרים, ארכיאולוגיה, פליאונטולוגיה, גיאולוגיה וביולוגיה1,2,3,4,5,6,7,8,9 . בין שיטות הדמיה לא הרסניות אלה, פלטפורמות מבוססות רנטגן שימושיות במיוחד בשל היכולת של צילומי רנטגן באנרגיה גבוהה לחדור סוגים וחומרים שונים רבים עם פיזור מינימלי בהשוואה לגלי אור נראים. טומוגרפיה ממוחשבת (CT), טומוגרפיה ממוחשבת מיקרו (μ-CT), טומוגרפיה ננו-ממוחשבת (ננו-CT) ומיקרוטומוגרפיה של סינכרוטרון התגלו, אם כן, כטכנולוגיות העיקריות להדמיה מבוססת קרני רנטגן של דגימות הנעות בין מטרים למיקרונים, עם יכולות רזולוציה מילימטריות עד תת-מיקרון10,11,12,13,14.
בעוד פלטפורמות אלה שונות בעיצובן, בגיאומטריית קרני הרנטגן וברכיבים שלהן כדי לאזן בין גודל דגימה לרזולוציה, כולן מסתמכות על אותו עיקרון בסיסי ללכידת תמונה: מקור לצילומי רנטגן העוברים דרך האובייקט ונלכדים על ידי גלאי. חיכוך דיפרנציאלי של קרן הרנטגן כשהיא עוברת דרך דחיסויות שונות בתוך האובייקט יוצרת ניגודיות תמונה. נתונים תלת-ממדיים מתקבלים על ידי סיבוב המדגם או הגלאי, איסוף סדרה של תמונות הקרנה 2D כי הם משוחזרים לאחר מכן באמצעות אלגוריתמים לתוך טומוגרמה המכילה מידע 3D שהרזולוציה שלהם היא איזוטרופית x, y,z15. עבור סורקי μ-CT רבים המשתמשים בגיאומטריית רנטגן של קרן חרוט כדי להקרין צילומי רנטגן באובייקט שממוצל, אלגוריתם פלדקמפ משמש לשחזור מדויק של האובייקט עם שגיאות מינימליות16.
הרזולוציה של פלטפורמה נתונה נקבעת בעיקר על ידי פרמטרי מערכת כגון גודל קרן הרנטגן (גודל ספוט), גיאומטריית סורק (מרחק מאובייקט למקור רנטגן), גודל הפיקסלים בגלאי ואלגוריתם השחזור המועסק. גורמים נוספים, כגון תנודות סורק, תנודות קרן רנטגן, תנועת מדגם, סוג החומר או כתם כימי המשמש לדמיין את האובייקט יכול גם להשפיע באופן משמעותי על רזולוציה מרחבית תחת condidtions הדמיה בעולם האמיתי15.
עבור יישומים ביו-רפואיים, CT ו- μ-CT מילאו תפקיד מרכזי בקידום הבנתנו מנגנוני אנטומיה, פיזיולוגיה, פיתוח ומחלות, המשמשים ככלי הן לאבחנות המטופלים האנושיים והן כפלטפורמת הדמיה פרה-אקלינית עבור אורגניזמים מודל17,18. לדוגמה, קונסורציום פנוטיפינג הבינלאומי עכבר, שמטרתו לזהות את הפונקציה של כל גן בגנום העכבר, משתמש μ-CT כחלק צינור פנוטיפינגשלהם 19. התוצאות שלהם היו קריטיות להבנת גנים המעורבים בתהליכי התפתחות ומחלות, ובמקביל שימשו אטלס לאנטומיה ופיתוח שלעכברים 20. אורגניזמים מודל אחרים, כגון דגי זברה וחולדות, אימצו גם את השימוש μ-CT לביצוע פנוטיפינג של בעלי חיים שלמים של מספר מוטציותגנים 17,21,22,23.
היתרון של שילוב הדמיה של בעלי חיים שלמים עם אורגניזמים לדוגמה הוא שניתן לחקור באופן מלא הבנה מכנית של תפקוד הגנים לתהליך ביולוגי נתון. זה אפשרי בגלל הגנומים המאופיינים היטב וכלים גנטיים רבים הזמינים באורגניזמים מודל המאפשרים מניפולציה מדויקת של תפקוד הגנים בנקודות זמן התפתחותיות ברורות, רקמות ספציפיות, תאים בודדים, ואפילו אברונים תת-תאיים. אלה כוללים מערכות ביטוי בינאריות כגון מערכת UAS /GAL4 (ונגזרותיה הרבות), CRISPR/Cas9 ו- RNAi24,25,26. כאשר כלים גנטיים אלה משמשים בשילוב עם צינור הדמיה רב עוצמה המורכב ממיקרוסקופיה אלקטרונית, מיקרוסקופיה קלה (פלואורסצנטית ולא פלואורסצנטית), והדמיה של בעלי חיים שלמים כגון μ-CT, הערכה יסודית של מולקולות, תאים, רקמות, איברים והאורגניזם כולו ניתן להשיג, המאפשר הבנה עמוקה הרבה יותר של תפקוד הגנים.
פרוטוקול זה מתמקד בשימוש μ-CT באורגניזם המודל הלא יונקי Drosophila melanogaster, שכליו הגנטיים הרבים עזרו להדגיש מנגנונים מולקולריים רבים26,27. הוא אומץ מפרוטוקולים קודמים בחרקים שאינם מודל1,28,29,30,31,32, ובונה ממחקרים קודמים μ-CT בדרוסופילים כדי לקבוע פרוטוקול סטנדרטי לשימושו בחיה זו 33 ,34,35,36,37,38,39 ,40,41. השלבים להכנה מוצלחת של מדגם, הדמיה וניתוח של ערכות נתונים fly μ-CT באמצעות סורקים זמינים מסחרית מפורטים. עם פרוטוקול זה, ניתן לדמיין את כל השלבים ההתפתחותיים של הזבוב ברזולוציה גבוהה הן עבור מחקרים תיאוריים והן למחקרי בדיקת השערה, כולל טקסונומיה, אנטומיה, פיתוח, פיזיולוגיה ומחלה27. פרוטוקול זה יהיה שימושי גם להדמיה כמעט כל חרק ואפילו חומרים שאינם חיים הדורשים כתמים כימיים עבור ניגודיות תמונה כדי לשפר את ההדמיה על ידי μ-CT.

<table><tbody><tr><td>100% Ethanol</td><td></td><td></td><td>For critical point drying</td></tr><tr><td>Bouin&#039;s Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT10132</td><td>For animal fixation</td></tr><tr><td>Critical Point Dryer</td><td></td><td></td><td>Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300)</td></tr><tr><td>Dragonfly Software</td><td>Object Research Systems</td><td></td><td>For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html</td></tr><tr><td>Heat Block</td><td></td><td></td><td>For microfuge tubes</td></tr><tr><td>Image Analysis Workstation</td><td></td><td></td><td>Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering</td></tr><tr><td>Iodine Solution (I&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;KI)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SI86-1</td><td>For staining</td></tr><tr><td>Microcomputed Tomography Scanner</td><td>Bruker</td><td>Skyscan 1172</td><td>Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 &amp;micro;m pixel size.</td></tr><tr><td>Microcomputed Tomography Scanner Software</td><td>Bruker</td><td></td><td>For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.)</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-15</td><td>For poking hole in cuticle</td></tr><tr><td>NRecon Image Reconstruction Software</td><td>Bruker</td><td></td><td>Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry</td></tr><tr><td>P10 pipet tips</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-120</td><td>Sample mounting</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Resarch Products International</td><td>P32060-4000.0</td><td>Dilute to 1X with water before use</td></tr><tr><td>Phosphotungstic Acid Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79690-25g</td><td>For staining</td></tr><tr><td>Pin Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td>For Minutien Pins</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Research Products International</td><td>111036</td><td>To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST)</td></tr><tr><td>X-Ray Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Xradia 520 Versa</td><td>Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD&amp;trade;)</td></tr></tbody></table>

whole animal imaging of drosophila melanogaster using microcomputed tomography

כלי הדמיה ביו-רפואיים מאפשרים חקירה של מנגנונים מולקולריים על פני קשקשים מרחביים, גנים ועד אורגניזמים. Drosophila melanogaster, אורגניזם מודל מאופיין היטב, נהנה משימוש במיקרוסקופיה אור ואלקטרון כדי להבין את תפקוד הגנים ברמה של תאים ורקמות. היישום של פלטפורמות הדמיה המאפשרות הבנה של תפקוד הגנים ברמה של האורגניזם השלם כולו ישפר עוד יותר את הידע שלנו על מנגנונים גנטיים. כאן מוצגת שיטת הדמיה מלאה של בעלי חיים המתארת את השלבים הדרושים כדי לדמיין את Drosophila בכל שלב התפתחותי באמצעות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (μ-CT). היתרונות של μ-CT כוללים מכשור זמין מסחרית וזמן מעשי מינימלי כדי לייצר מידע תלת-ממדי מדויק ברזולוציה ברמת מיקרון ללא צורך בשיטות ניתוח רקמות או ניקוי. בשילוב עם תוכנה המאיצה ניתוח תמונה ועיבוד תלת-ממדי, ניתן לבצע ניתוח מורפומטרי מפורט של כל מערכת רקמות או איברים כדי להבין טוב יותר מנגנוני פיתוח, פיזיולוגיה ואנטומיה הן למחקרי בדיקה תיאוריים והן למחקרי בדיקת השערה. על ידי שימוש בתהליך הדמיה המשלבת שימוש במיקרוסקופיה אלקטרונית, מיקרוסקופיה קלה ו- μ-CT, ניתן לבצע הערכה יסודית של תפקוד הגנים, ובכך לקדם את התועלת של אורגניזם מודל רב עוצמה זה.

איור 2 מציג תמונות של עובר, זחלי אינסטאר3, גלמים בשלב הבוגרים של פארה (P7), וזבוב מבוגר מוכתם ביוד ודמותו מיובשת במים באמצעות סורק ספסל מסחרי. שימור מעולה ואפילו כתמים של רקמות עדינות נראים לעין, ומאפשרים לזהות בקלות את כל האיברים העיקריים ולהשתמש בהם לניתוח מורפומטרי והדמיה תלת ממדית.
בדרך כלל, סריקות שרוכשות פחות תמונות הקרנה של הדגימה מספקות רזולוציה נמוכה יותר מאשר סריקות שרוכשות יותר תמונות הקרנה, כאשר ההחלפה היא זמן שהוקדש לסריקה. למרות זמני הסריקה ישתנו על ידי מכשיר ופרמטרים אחרים סריקה, סריקות לרכוש כמה מאות תחזיות (~ 3 מיקרומטר גודל פיקסל תמונה) לוקח בערך 30 דקות לכל דגימה, בעוד סריקות המורכבות אלפי תמונות הקרנה (700 nm-1.25 μm גודל פיקסל תמונה) יכול לקחת 8-16 שעות. השוואה של אותה כיסוי ראש זבוב למבוגרים שצולם הן במצב סריקה 'איטי' (אלפי תחזיות) והן במצב סריקה 'מהיר' (מאות תחזיות) מוצגת באיור 3. חשוב לציין, ניתוחים מורפומטריים אינם שונים בין סריקות 'איטיות' ו'מהירות' (איור 3C)40. צינור ההדמיה שלנו, אם כן, משתמש בסריקות מהירות כדי ליצור גודל מדגם גדול מספיק לניתוח מורפומטרי, וסריקות איטיות כדי לדמיין פגמים מורפולוגיים או אנטומיים ברזולוציה גבוהה יותר. באמצעות התוכנה (שלב 7), כל רקמה או מערכת איברים של עניין ניתן לפלח ולהשתמש לניתוח מורפומטרי ודמיינו בתלת-ממד באמצעות יוצר הסרטים (סרט 1).
איור 4 מראה דוגמה של הבטן הזבוב מוכתם עם PTA ו התמונה hydrated (מים) או בעקבות ייבוש נקודה קריטית (CPD) על מיקרוסקופ רנטגן (שולחן החומרים). הפרטים המוענקים על ידי שילוב של ועד ההורים והיכולות של פלטפורמה זו ניכרים בקלות בתמונות אלה, כך שתאי אפיתליה בודדים של מידגוט וחבילות זרע בתוך האשכים נפתרים בקלות. בעוד שתמונת CPD מראה רזולוציה מוגברת שולית בהשוואה לדגימה hydrated, שימור טוב יותר של אולטרה מבנה של רקמות עדינות (כגון תאי השומן ליד החתך) מושגת עם דגימות hydrated(סרט 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig01.jpg"> איור 1: מבט כולל על עיצוב הסורק והרכבת הדגימה עבור μ-CT. (A)ספסל מסחרי μ-CT סורק. (B)הצג בתוך הסורק. מקור הרנטגן (מימין) פולט צילומי רנטגן העוברים דרך המדגם הממוקם על שלב מסתובב (חץ צהוב). ההנחיה של צילומי רנטגן אלה יוצרת ניגודיות תמונה כאשר הם עוברים דרך המדגם אל הגלאי, המורכב ממסך נוצץ הממיר צילומי רנטגן לפוטונים ומצלמת CCD סטנדרטית (משמאל). (ג)הרכבה של זבוב פירות בוגר להדמיה מיובשת במים. נקודות החיבור בין קצה הפיפטה למחזיק הפליז עטופים בסרט פרפין למניעת דליפה ונזק פוטנציאלי לסורק. גם צ'אק הבמה מודגש. שימו לב שקצה הפיפטה היה ממוקם מעט מחוץ לציר, מה שהוביל לזמן סריקה ארוך יותר ולצמצום הרזולוציה בשחזור הסופי. (D)תמונת הקרנה דו-ממדית אחת של זבוב נקבה בוגר; מאות עד אלפי תחזיות אלה נרכשות במהלך סריקה לאורך ציר הסיבוב ומשמשות לשחזור כדי ליצור טומוגרמה המכילה רזולוציה איזוטרופית ומידע תלת-ממדי מדויק. מוטות קנה מידה (C) = 2 מ"מ. P, אחורי; וי, גחון. נתון זה שונה מ Schoborg ואח'40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig02.jpg"> איור 2: כל שלבי מחזור החיים של Drosophila melanogaster, בתמונה על ידי μ-CT. דגימות מוכתמות ביוד ותמונה hydrated במים. מוצג פרוסה 2D יחיד. (א)עובר שהשלים את השלבים המוקדמים של גסטריולציה (כוכבית). (B)זחל כוכב שלישי. (C)P7 pharate מבוגר במהלך מטמורפוזה. (ד)נקבה בוגרת. איברים שונים מודגשים: BWM, שרירי דופן הגוף; בר, מוח; דיסק, קרדיה; Cr, יבול; DLMs, שרירי אורך שרירי גלשית שרירים; DVM, שרירי גחון גחון שרירים; E-AD, דיסק אנטנה לעיניים; אם, עובר; FB, גופים שמנים; FBCs, תאי גוף שומן; ח', לב; ה"ג, הינדגוט; לה, למינה; L, רגל; מ"ג, מידגוט; OL, אונה אופטית במוח; אוב, ovipositor; PC, ציפורניים pupal; ס"ג, בלוטות רוק; VNC, כבל עצב גחוני; W, כנף; WD, דיסק כנף. מוטות קנה מידה (A) = 100 מיקרומטר; (B)-(D) = 500 מיקרומטר. D, דורסל; א' ל', שמאלה. פרמטרי סריקה: מקור למרחק דגימה (מ"מ): (A, D) 36.5, (B) 48.8, (C) 40.3. מקור למרחק מצלמה (מ"מ): (A, D) 350, (B, C) 285. גודל פיקסל מצלמה (מיקרומטר): (A-D) 11.6. גודל פיקסל תמונה (מיקרומטר): (A, D) 1.2, (B) 1.9, (C) 1.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig03.jpg"> איור 3: פרמטרי סריקה ורזולוציית תמונה אינם משנים ניתוחים מורפומטריים. ראש מבוגר נסרק באמצעות הגדרות הסורק 'מהיר'(A, A') (מאות תחזיות) והגדרות הסורק 'איטי' (אלפי תחזיות) ו-(B, B') (אלפי תחזיות). המוח מתואר בצהוב. (C)מדידות נפח המוח מסריקות איטיות ומהירות. מבנים מודגשים: אל על; אונת האנטנה; CB, מוח מרכזי; FB, גוף בצורת מאוורר; FCs, תאי שומן; לה, למינה; לו, לובולה; LoP, צלחת לובולה; אני, מדולה; רי, רשתית. n = 5, מבחן t של וולש. ns = לא משמעותי. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. פרמטרי סריקה: מקור למרחק דגימה (מ"מ): (A) 44.4, (B) 36.5. מקור למרחק מצלמה (מ"מ): (A) 348 (B) 350. גודל פיקסל מצלמה (מיקרומטר): (A-B) 11.6. גודל פיקסל תמונה (מיקרומטר): (A) 2.95, (B) 1.2. נתון זה שונה מ Schoborg ואח'40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig04.jpg"> איור 4: הבטן של דרוזופילה מלנוגאסטר בתמונה של מיקרוסקופיה של קרני רנטגן. הבטן הוכתמה עם 0.5% PTA ותמונה hydrated (מים) או בעקבות ייבוש נקודה קריטית (CPD). (A)נקודה קריטית בטן מיובשת, מוצג מנקודת המבט YZ ו (A') XZ בפרספקטיבה. (B)בטן מיובשת, מוצג מנקודת המבט של YZ ו -(B') XZ בפרספקטיבה. איברים שונים מודגשים: FC, תאי שומן; ה"ג, הינדגוט; מ"ג, מידגוט; SP, משאבת זרע; טה, אשכים. מוטות קנה מידה (A) = 250 מיקרומטר. D, דורסל; א' ל', שמאלה. פרמטרי סריקה: מקור למרחק דגימה (מ"מ): (A) 6.7, (B) 7. מקור למרחק מצלמה (מ"מ): (A) 28 (B) 29.5. מטרה: (A-B) 4X. גודל פיקסל תמונה (מיקרומטר): (A-B) 0.65. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
סרט 1: זחל כוכב שלישי, שניתן בתלת-ממד באמצעות יוצר הסרטים בדרקון. איברים מודגשים כוללים את המוח (צהוב), דיסקים דמיוניים עיניים-אנטנה (אדום), גוף השומן (כחול) ואת שרירי דופן הגוף (ירוק). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61515/Movie_1_Revised.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.</a>
סרט 2: השוואה בין דוגמאות שתמונות במים או מעקב אחר ייבוש נקודות קריטי. בטן מוכתמת עם 0.5% PTA מוצגים. שתי הבטן נסרקו עם הגדרות זהות בגודל פיקסל תמונה (0.65 מיקרומטר). סדרה של פרוסות דו-ממדיות מוצגות בתבנית 'Z-stack' (YZ) החל ממשטחת הגדש וכלה במשטח הגחון של הבטן. איברים מודגשים: FC, תאי שומן; מ"ג, מידגוט; SP, משאבת זרע; טה, אשכים. פרמטרי סריקה: מקור למרחק דגימה (מ"מ): (A) 6.7, (B) 7. מקור למרחק מצלמה (מ"מ): (A) 28 (B) 29.5. מטרה: (A-B) 4X. גודל פיקסל תמונה (מיקרומטר): (A-B) 0.65. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61515/Movie_2_Revised.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography at JoVE.com

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

פרוטוקול מוצג המאפשר הדמיה של Drosophila melanogaster שלם בכל שלב של פיתוח באמצעות טומוגרפיה מיקרו מחשב.

הדמיה חיה שלמה של Drosophila melanogaster באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

whole-animal-imaging-drosophila-melanogaster-using-microcomputed

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

4.8K Views.  University of Wyoming. פרוטוקול מוצג המאפשר הדמיה של Drosophila melanogaster שלם בכל שלב של פיתוח באמצעות טומוגרפיה מיקרו מחשב.

Video: Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Biology

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and computational modeling to classify and compare biological processes. Although cell culture model systems are great for high content imaging, high throughput studies of cell morphology suggest that ex vivo cultures are limited in recapitulating the morphological complexity found in cells within living organisms. As such, there is a need for a scalable high throughput model system to image living cells within an intact organism. Described here is a protocol for using a high content image analyzer to simultaneously acquire multiple time-lapse videos of embryonic Drosophila melanogaster development during the syncytial blastoderm stage. The syncytial blastoderm has traditionally served as a great in vivo model for imaging biological events; however, obtaining a significant number of experimental replicates for quantitative and high-throughput approaches has been labor intensive and limited by the imaging of a single embryo per experimental repeat. Presented here is a method to adapt imaging and microinjection approaches to suit a high content imaging system, or any inverted microscope capable of automated multipoint acquisition. This approach enables the simultaneous acquisition of 6-12 embryos, depending on desired acquisition factors, within a single imaging session.

Presented here is a protocol to microinject and simultaneously image multiple Drosophila embryos during embryonic development using a plate-based, high content imager.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

נוקשה ההטמעה של קבוע, צבעונית, ככלל, דגימות מילימטר-סולם עבור היסטולוגיה ללא סעיף תלת-ממד על-ידי מיקרו-שחושב טומוגרפיה

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Bioengineering

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

אין ויוו מעקב אחר בתחנת האוטובוסים Presynaptic עצבים מוטוריים דרוזופילה מולקולה בודדת

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Neuroscience

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

הכנת מלנוגאסטר דרוזופילה למבוגרים להדמיית מוח שלמה במהלך תגובות התנהגות וגירויים

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

הכנת תסיסנית והדמיה אורכית תפקוד הלב in vivo באמצעות מיקרוסקופית קוהרנטיות אופטית (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique cristae-rich double membrane ultrastructure of this organelle is elegantly arranged to carry out multiple functions by partitioning biomolecules. Mitochondrial ultrastructure is intimately linked with various functions; however, the fine details of these structure-function relationships are only beginning to be described. Here, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle. Serial-section electron tomography may be adapted to study any cellular structure in three-dimensions.

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

In this protocol, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle.

Ultrastructure מיטוכונדריאלי תלת-ממד של שריר טיסה עקיף דרוזופילה התגלה על ידי אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

הדמיה חיה שלמה של Drosophila melanogaster באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video