Nasser Rusan'ın desteği olmasaydı bunların hiçbiri mümkün olmazdı. Nih Fare Görüntüleme Tesisi'nden H. Doug Morris, Danielle Donahue ve Brenda Klaunberg'e ve Micro Photonics'den Ben Ache'ye eğitim ve yararlı tartışmalar için teşekkür ederim. Ayrıca Zeiss'li Mansoureh Norouzi Rad'e Xradia 520 Versa'daki karın örneklerini taradığınız için teşekkür ederim. Lauren Smith, Samantha Smith ve Rachel Ng de taramaya yardımcı oldu. Nesne Araştırma Sistemleri'nden Mike Marsh, Dragonfly teknik desteği sağladı. Ayrıca Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (1K22HL137902-01) ve Wyoming Üniversitesi'nden Start Up Fonları desteği için minnettarım. Ayrıca anonim yorumculara yararlı önerileri ve yorumları için teşekkür ederim.

1. Örnek seçimi ve manikül hazırlığı
<ol><li>Görüntüleme için uygun gelişimsel zaman noktasını (embriyo, larva, pupa veya yetişkin) seçin.<ol>
<li>Embriyonik aşamalar için, maya ezmesi ile bulaşmış üzüm suyu agar tabaklarındaki kafes dişileri ve her 30-60 dakikada bir yumurta toplayın. Uygun aşamaya gelene kadar bu embriyoları 25 °C'de gelişmeye bırakın.</li>
		<li>Larva aşamaları için, zamanlanmış embriyo toplama deneylerinden birinci ve ikinci instarları toplayın. Kalabalık olmayan koşullar altında yiyecek şişesinin yanından doğrudan 3rd instars seçin.</li>
		<li>Pupal zamanlama için, beyaz pupa öncesi (ters spiracles) toplayın ve kıtikalenin kahverengi olmaya başladığı zamanı not edin. Hayvanlar, tiktik kahverengimsi takiben tanımlanmış zaman noktalarında pupal gelişiminin 15 aşamasında ilerleyecek ve buna göre toplanabilir42.</li>
		<li>Yetişkinleri eklozyonu takiben bakire olarak toplayın ve gerekli bir süre boyunca bir gıda şişesinde yaşlanmaya izin verin (örneğin, tam bağırsak gelişimi için 5 gün).</li>
	</ol>
</li>
	<li>5-50 hayvanı 1x Fosfat Tamponlu Salin 'de (%0,5 PBST) %0,5 Triton X-100'ün 1 mL'sini içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tezgahta periyodik olarak tüpe dokunurken, hidrofobik kaplamanın çıkarılmasına yardımcı olmak ve hayvanların tamamen suya batmasına izin vermek için oda sıcaklığında (RT) 5 dakika kuluçkaya yatırın.<ol>
<li>Embriyonik, larva ve pupal aşamaları için, tüpü 20 s için 100 ° C'ye ayarlanmış bir ısı bloğuna yerleştirerek ve ardından RT'de 5 dakika soğutarak daha fazla gelişmeyi kesin. NOT: Hayvanlar sıvı nitrojen37'deflaş dondurulabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fiksasyon ve boyama
<ol><li>%0,5 PBST'yi çıkarın ve Bouin'in Çözümünden 1 mL ekleyin. Hayvanların tamamen su altında kalmasını sağlamak için tüpe dokunun. DİkKAT: Bouin'in Çözümü formaldehit içerir. Dökülürse cilt ve gözlere akut toksisiteye neden olabilir ve yutulabilirse ölümcül olabilir. Kullanırken eldiven, güvenlik gözlüğü ve laboratuvar önlüğü giyin. NOT: Etanol kullanımı gibi ek fiksasyon teknikleri de kullanılabilir. Diğer fiksatiflerin yararlarıref. 1,30.<ol>
<li>Embriyo ve yetişkin örnekleri için RT'de 16-20 saat boyunca tezgahta kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Larva ve pupal örnekleri için, RT'de hayvanları 2 saat sabitle. 1x PBS içeren çok iyi bir diseksiyon kabına aktarın ve ön ve arka kütiküldeki bir deliği dürtmek için bir tutucuya bağlı küçük bir minutien pim kullanın.</li>
		<li>Larva ve pupal örneklerini bir mikrofuge tüpüne geri aktarın ve 1 mL taze Bouin çözeltisi ekleyin. RT'de 24 saat boyunca tezgahta kuluçkaya yaslanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bouin'in Çözeltisi'ni çıkarın ve numuneyi 1 mL μ-CT Yıkama Tamponu (0,1 M Na 2 HPO4,%1,8Sakkaroz) veya 1x PBS üç kez ile 30 dakika yıkayın.</li>
	<li>Uygun boyama çözeltisinin 1 mL'sini ekleyin ve 2-7 gün boyunca tezgahta kuluçkaya yatırın. NOT: Leke seçimi birçok faktöre bağlı olacaktır, ancak genellikle penetrasyon, kuluçka süresi ve çözünürlük arasındaki bir dengedir. Genel olarak, fosforungstik asit (PTA) yumuşak dokunun üstün kontrastını ve çözünürlüğünü sağlar, ancak kütikülün mekanik bozulmasını ve daha uzun kuluçka sürelerini gerektirir. Farklı leke tiplerinin yararları ref.1'de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.<ol>
<li>İyot boyama için 1 mL 0.1 N I2KI (Lugol Çözeltisi) kullanın. 2 gün kuluçkaya yatır. Yetişkin manikülde daha fazla bozulmaya gerek yoktur.</li>
		<li>Fosfoungstik asit (PTA) boyama için, suda seyreltilmiş% 0,5 (w / v) çözeltinin 1 mL'sini kullanın. Bir tutucuya bağlı küçük bir minutien pim ile toraks veya abdominal kütiküldeki ağız partilerini veya delikleri dürterek yetişkin kütiküllerini bozun. Doku lekesi homojen değilse 5-7 gün veya daha uzun süre kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>30 dakika boyunca 1 mL ultra saf su veya 1x PBS ile yıkayın. Yıkama adımlarını tekrarlayın. Rt'de hayvanları ultra saf suda veya 1x PBS'de bir aya kadar saklayın.</li>
	<li>Hayvanlar nemlendirilirken taranacaksa, doğrudan bölüm 4'e geçin. Numunenin daha uzun süre korunması gerekiyorsa, protokolün bölüm 3'üne geçin.</li>
</ol>3. Kritik nokta kurutma (İsteğe bağlı)
<ol><li>Numune üzerinde bir etanol (EtOH) dehidrasyon serisi gerçekleştirin: %10, %25, %50, %75, %100, %100. EtOH çözeltisinin 1 mL'lik kısmını ekleyin ve belirtilen sırayla her konsantrasyon için 1 saat boyunca tezgahta kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Son % 100 EtOH ıslatıldıktan sonra, taze% 100 EtOH ile değiştirin ve numunenin tezgahta bir gecede kuluçkaya yatmasına izin verin.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına uyarak numunelerin kritik nokta kurutmasını gerçekleştirin. NOT: Elektron mikroskopi tesisleri genellikle EtOH dehidratasyonunu takiben numuneninkurumasını gerçekleştirecek kritik bir nokta kurutma makinesine (bkz. Malzeme Tablosu) sahiptir.</li>
</ol>4. Numune montajı
<ol><li>Kritik nokta kurutulmuş numuneler için, dönen aşamanın aynasına sığacak şekilde tasarlanmış bir böcek pimine veya başka bir tutucuya sıcak tutkal örnekleri veya plastik veya cam kılcal boruya (~1,0-1,25 mm iç çap) yerleştirin.</li>
	<li>Hidratlı numuneler için, bir P10 pipet ucunu suyla doldurun ve sızıntıyı önlemek için dar ucunu ısı sızdırmazlık veya parafin filmi ile sabitleyin. DİkKAT: Suyun tarayıcıya sızmaması ve hasara yol açmaması için bağlantıları sıkıca sardığınızdan emin olun.<ol>
<li>Tek bir örneği tokmak kullanarak pipet ucuna aktarın. Körelmiş 20 G iğne veya başka bir pipet ucu gibi uzun, ince bir nesne kullanarak, numuneyi yerinde tutmak için pipet ucunun duvarına temas edene kadar dikkatlice uçtan aşağı itin.</li>
		<li>Uzun taramalar sırasında suyun buharlaşmasını önlemek için pipet ucunun açılmasını parafin filmi ile örtün.</li>
		<li>P10 pipetini döner sahnenin aynasına sığacak şekilde tasarlanmış bir tutucu kullanarak monte edin (Şekil 1A-C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Tarama
<ol><li>Gün için görüntülemeden önce makinenin gerekli kalibrasyonlarını gerçekleştirin. NOT: Bunlar üreticiye göre değişecektir ve uygun adımları belirlemek için bir uygulama uzmanına danışmanız önerilir. Bu protokolde kullanılan kurulum ve yazılım hakkında özel bilgi için lütfen Malzeme Tablosu'na bakın. Genellikle, mandrenin dönen aşamaya göre eksen dışında olmasıyla ilişkili herhangi bir 'sallantıyı' kaldırmak ve kameradaki tekdüze arka plan piksel yoğunluklarını sağlamak için düz alan düzeltmeleri yapmak için sahne ekseni hizalaması gibi kalibrasyonlar, birden fazla taramada karşılaştırılabilir en iyi çözünürlük ve veri kümeleri için en uygun görüntüleme koşullarını sağlar.</li>
	<li>Yazılımın sol üst köşesindeki 'Kapıyı Aç' simgesine tıklayarak dönen sahne aynasına erişmek için tarayıcı kapısını açın. Yakayı numune tutucunun tabanına sıkarak numuneyi takın. NOT: Tarayıcı hizalamasını korumak için numuneyi dönen aynaya taktırırken hafif basınç kullanın.</li>
	<li>Tarayıcıyı en iyi çözünürlük ve kontrast için kontrol eden yazılımda tarama parametrelerini ayarlayın. NOT: Her tarayıcının X-ışını kaynağı, kamerası/dedektörü ve geometrisi üreticiye göre değişeceğinden bunların ampirik olarak belirlenmesi gerekecektir. En iyi parametreleri seçmek için ek bilgileri burada da bulabilirsiniz43, ayrıca üreticinin uygulama uzmanından.<ol>
<li>X-Ray kaynak güç kontrolünü açma (Seçenekler | X-ray Kaynağı). X-ışını voltajını 30-40 kV'a ve akımı 100-110 μA'ya ayarlamak için kaydırıcı çubuklarını kullanın ve gelişmiş çözünürlük için 3-4W güce ve küçük bir spot boyutuna sahip bir X-ışını ışını üretin.</li>
		<li>Edinme Modları iletişim kutusunu kullanma (Seçenekler | Alma Modları) kamera pozlama süresini 500-800 ms olarak ayarlamak için.</li>
		<li>Kamera ayarlarına ve konumuna bağlı olarak istenen görüntü piksel boyutunu (~700 nm ila 4 μm) ayarlamak için yazılımın altındaki büyüteç simgesinin yanında bulunan kaydırıcı çubuğunu kullanın. Bu, tarama sırasında elde edilen projeksiyon görüntülerinin sayısını belirler ve daha fazla projeksiyon gelişmiş çözünürlüğe ancak daha uzun tarama sürelerine yol sağlar (bkz. Temsili Sonuçlar).</li>
		<li>Örneği 360° döndürme yolu boyunca taşımak için yazılımın altındaki dönen okun yanında bulunan kaydırıcı çubuğunu tıklatıp sürükleyin. Örneğin görüş alanında kaldığından emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yazılımın üst kısmındaki 'Edinmeye Başla' simgesine (mavi daire ok simgesi) tıklayın. Ek tarama parametrelerinin ayarlanıp taramanın kaydedileceği dosya ve çıktı klasörünün adlandırılmasına izin veren bir iletişim kutusu görüntülenir.<ol>
<li>Rastgele hareketi 10 ve ortalama 4-6 kareye ayarlayın. Döndürme adımı, kullanılan kamera ayarlarına bağlı olarak otomatik olarak hesaplanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Edinme iletişim kutusunda'Tamam'ı tıklatarak taramaya başlayın. Tarama süresini gösteren ikinci bir ilerleme çubuğu iletişim kutusu görüntülenir. Tarayıcı artık dönüş yolu boyunca numunenin bir dizi projeksiyon görüntüsü(Şekil 1D)elde edecek ve izlenmesine gerek yok.</li>
</ol>6. Yeniden Yapılanma
<ol><li>Tomogramları oluşturmak için projeksiyon görüntülerini kullanarak görüntü yeniden yapılandırma gerçekleştirin. NOT: Koni ışını geometri tarayıcılarından gelen görüntülerin hemen hemen tüm rekonstrüksiyonu Feldkampalgoritması 16'ya dayanırken, bireysel parametreler yazılım uygulamasına bağlı olarak değişecektir ve ampirik olarak belirlenmelidir. Ticari olarak kullanılabilen bir yazılıma özgü aşağıdaki ayarlar (bkz. Malzeme Tablosu)kılavuz olarak kullanılabilir. Yanlış hizalama telafisi, halka yapıt azaltma ve ışın sertleştirme düzeltmesi (çoğu sinek örneği için%0) gibi parametreler, son rekonstrüksiyon için en iyi değerleri seçmek için yinelemeli bir şekilde gerçekleştirilir. Yeniden yapılandırma süreci üzerinde daha fazla kontrol sahibi olmak isteyen ileri düzey kullanıcılar için, matlab arayüzüne bakın44.</li>
	<li>Başvuru taramalarına dayalı bir vardiya düzeltme algoritması kullanarak ilk görüntü hizalamasını gerçekleştirme45 (Eylemler | Referans taramasıyla X/Y hizalaması).
</li>
	<li>Her yeniden yapılandırma parametresine ince ayar yapın (Başlangıç | İnce ayar). Bu, bir 'Parametre ince ayarı' iletişim kutusunu etkinleştirir.<ol>
<li>'İleri' ile 'Hizalama Sonrası'nı tıklatarak hizalamaya ince ayar yapın. Yineleme sayısını beşe ve parametre adımını 1,0 olarak ayarlayın. Bir dizi önizleme oluşturmak için Başlat düğmesini tıklatın. Düzgün hizalanmış görüntüyü seçin. NOT: Düzgün hizalanmış bir görüntü bulanık olmayacak veya aksi halde sürekli bir yapının (nikle gibi) bölünmüş göründüğü 'yamumlu' yapıları görüntülemeyecektir.</li>
		<li>Yanındaki halka yapıt azaltmayı tıklayarak ince ayar yapın. Yineleme sayısını beşe ve parametre adımını 1,0 olarak ayarlayın. Bir dizi önizleme oluşturmak için Başlat düğmesini tıklatın. En az sayıda halka içeren resmi seçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yukarıdaki parametreler en iyi görüntüyü verecek şekilde optimize edildikten sonra, seçilen değerlerin Ayarlar sekmesinde(Ayarlar) düzgün bir şekilde temsil edildiğinden emin olun.
</li>
	<li>Histogramı, bit derinliği ve türü gibi dosya parametrelerini kullanarak son parlaklık ve kontrast değerlerini ayarlayın ve hesaplama süresini(Çıktı)azaltmak için yalnızca ilgi alanlarını (örneğin, yalnızca tüm sinek veya kafa) kapsayan bir İlgi Alanı (ROI) kullanın.</li>
	<li>Yeniden yapılandırmaya başlayın (| başlayın Başlat). Birden çok yeniden yapılandırma gerekiyorsa, geçerli görüntüyü toplu iş yöneticisine ekleyin (Başlangıç | Toplu işleme ekle) ve kalan görüntüler için 6.2-6.5 adımlarını yineleyin.</li>
</ol>7. Görüntü analizi
<ol><li>Tomogramları iki ve üç boyutta görselleştirin ve ücretsiz veya ticari yazılımlarla daha fazla morfometrik analiz gerçekleştirin. NOT: Bu protokolde kullanılan yazılımın ayrıntıları Malzeme Tablosu'nda mevcuttur. μ-CT veri kümelerini değerlendirebilen diğer yazılım paketleri arasında FIJI46, Seg3D (www.seg3D.org)47ve ITK-SNAP48gibi ücretsiz seçeneklerin yanı sıra ticari yazılımlar (örneğin, AMIRA) bulunur. Segmentasyon sürecini yarı otomatikleştirmek için makine öğrenimi tabanlı algoritmalar kullanan diğer uygulamalar, iş akışlarını hızlandırmaya ve insan önyargısını azaltmaya yardımcı olabilir (örneğin, Biomedisa49).</li>
	<li>Tomogram dosyasını yazılıma içe aktarma (Dosya | Görüntü Dosyalarını İçeri Aktar). Dosyayla ilişkili meta veriler otomatik olarak pencereye yüklenmelidir, ancak görüntü özellikleriyle eşleşecek şekilde el ile de ayarlanabilir.</li>
	<li>İlgi çekici bir yapıyı segmentlere ayırmak için ekranın sol tarafındaki Segment sekmesini tıklatın. Yeni bir İlgi Alanı (YATıRıMGK) Oluşturma (Temel | Yeni), ona bir ad verin ve uygun bir renk seçin.</li>
	<li>İlgi yapısını kapsayan eşik aralığını tanımlama (Aralık | Aralığı Tanımla) kaydırıcı çubuğunu kullanarak.</li>
	<li>Uygun bir 2D veya 3D YATıRıM GETIRIsi boyacı araç modu seçin (YATıRıM GETIRI'sine | Boya fırçası seçeneği).
</li>
	<li>Eşik tarafından tanımlanan bir alanı boyamak için; sol fare tuşunu basılı tutarken Ctrl tuşunu basılı tutun. Bir alanı kaldırmak için, sol fare tuşunu basılı tutarken Shift tuşunu basılı tutun. NOT: Dairesel veya kare boya fırçasının boyutunu değiştirmek için, Ctrl veya Shift tuşlarını basılı tutarken fare tekerleğini kaydırmanız yeterlidir.</li>
	<li>Tüm Z hacmi boyunca ilgi yapısını boyamaya devam edin.</li>
	<li>Yatırım Getirisini Mesh'e Dönüştürme (Dışa Aktarma | Mesh | Normal).
</li>
	<li>Sağ üst köşedeki Veri Özellikleri ve Ayarları panelinde üzerine tıklayarak kafes kaplamasını vurgulayın.</li>
	<li>Uygun sayıda yineleme kullanarak ağı düzleştirin(Düz Mesh | Yinelemeler). NOT: Karşılaştırılacak tüm görüntüler için aynı mesh yumuşatma yineleme değerini kullanın.</li>
	<li>Temel morfometrik analiz için ekranın sağ tarafındaki Bilgi panelinde ağ yatırım getirisinin(Yüzey Alanı, Hacim ve Feret Çapı)ölçümlerinin görüntülendiğinden emin olun. Nesne Çözümleme Modülükullanılarak ek analiz yapılabilir.</li>
	<li>Kafes nesnesini ve tüm tomogram görüntüsünü işle ve 3B olarak görselleştir. Nesnenin videosunu oluşturmak için yerleşik Movie Maker'ı kullanma (Sağ Fare Tıklatmasını | Movie Maker'ı görüntüleyiciden tek tek kareler kullanarak göster (Anahtar Ekle). NOT: Belirli özellikleri vurgulamak için sağ paneldeki görsel efektler sekmesi kullanılarak filme çeşitli görsel geliştirmeler de uygulanabilir.</li>
	<li>Movie Maker'daki Animasyonu Dışa Aktar düğmesini kullanarak videoyu görüntülemek üzere dışa aktar.</li>
</ol>

Yazar hiçbir rekabet veya finansal çıkar beyan etmemektedir.

Tüm gelişim aşamalarında bozulmamış Drosophila melanogaster'ı görselleştirmek, öncelikle ışık mikroskopisinin bu hayvanda bulunan kalın, pigmentli kütikülle uyumsuzluğu nedeniyle bir zorluk olmaya devam etti. Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRG), Optik Koherens Tomografi (OCT) ve ultramikroskop doku temizleme ile birleştiğinde diğer tüm hayvan görüntüleme yöntemleri sineklerde başarı ile kullanılmıştır50,51,52,53,54, μ-CT bu organizmanın tüm hayvan görüntülemesi için ideal kılan bir dizi avantajsunarken 13 , 15,30 . X ışınları pigmentli kütiküllere kolayca nüfuz eder ve küçük dalga boyları mikron altı görüntülemeye izin verir. Etiketleme, yaygın olarak bulunan kimyasallara minimum yatırım gerektirir ve özel tezgah becerileri yoktur13. μ-CT tarayıcılar da ticari olarak mevcuttur ve maliyetler hafif mikroskopi platformlarıyla karşılaştırılabilirken, aynı zamanda bir kurumda kullanılabilirliğinden de yararlanabilecek daha geniş disiplinler (Jeoloji, Paleontoloji, Mühendislik vb.) için daha çekicidir. Senkrotron X-Ray kaynakları, sabit ve canlı böceklerin31,55,56,ancak ticari tezgah üstü tarayıcılardan daha az erişilebilir olan yüksek çözünürlüklü μ-CT görüntülemesi için de kullanılabilir.
Bu protokol, sinek yetişkinleri, pupa, larva ve hücreselleştirilmiş embriyoların μ-CT görüntülerini elde etmenin etkili bir yolunu sağlar. Yukarıda özetlenen adımların çoğu için, görüntüleme için örnekler hazırlamak için alternatif yöntemlerin de uygulanabileceğini unutmayın. Diğer çalışmalar, böceklerde kullanılmak üzere farklı sabitleme, etiketleme ve kurutma adımlarının ayrıntılı bir karşılaştırmasını sağlamıştır ve bu tekniği benimsemek isteyenler, her yaklaşımın yararlarını değerlendirmeye teşvik edilir 1 ,4,13,29,30,57. Bu protokol nispeten basit olsa da, birkaç yararlı öneri sunulmaktadır.
İlk olarak, alttaki yumuşak dokuların önemli ölçüde bozulmaması için sağlam örneklerin seklisini bozarken dikkatli olunmalıdır. Larva ve erken pupal aşamalarının dürtmeden önce Bouin'in çözeltisinde 2 saat boyunca sabitlenmesine izin vermek önemlidir. Bu, dokuyu sertleştirecek ve organ mimarisini değiştirebilecek lütikül deliklerinden sızacak hemolimf miktarını sınırlayacaktır. İlgi çekici yapı (lar) orada bulunuyorsa, yetişkinin bireysel vücut segmentleri (baş, toraks ve karın) ayrılabilir. Bu segmentleri forsepsle ayırmak yerine temiz bir şekilde dilimlemek için bir neşter kullanılması önerilir, bu da örneğin bağırsak veya merkezi sinir sisteminin 3D mimarisini bozabilir. Zamanlama gelince, yetişkinler genellikle sadece 16 saat gerekir. tam fiksasyon için larva ve pupal aşamaları 24 saat gerekir. Ayrıca, iyot veya PTA lekesi düzensiz görünüyorsa, numune lekeleme bile elde edilene kadar daha uzun süre kuluçkaya yatmak için çözeltiye geri yerlenebilir. Son olarak, nemlendirilmiş numuneler 4 ° C'ye yerlendirilmemelidir, çünkü bu, oda sıcaklığına ısındıktan sonra vücut boşluğu içinde hava kabarcıklarının oluşumunu teşvik ediyor gibi görünmektedir.
İkinci olarak, numune montajı alete, sahne tipine ve numunenin hidratlı kalması gerekip gerekmediğine veya kritik noktanın kurutulup kurutulmadığına göre değişir. Nemlendirilmişse, numunenin sızmadığından emin olun ve muhtemelen tarayıcıyı yok edin. Numuneyi bir pipet ucunun içine monte ederken, numuneler hafif bir dirençle karşılaşana ve hareket edemeyinceye kadar körelmiş bir nesneyle hafifçe itdiğinizden emin olun. Çok fazla itmek oksikül deformasyonuna ve alttaki yapısal kusurlara yol açabilir. Ayrıca, numunenin tutucuda dönme eksenine mümkün olduğunca yakın hizalı olduğundan emin olun. Herhangi bir yalpalama, daha geniş görüş alanı nedeniyle tarama sürelerini artıracak ve yeniden yapılanma sonrasında son tomogramın çözünürlüğünü azaltacaktır.
Üçüncü olarak, projeksiyon görüntülerini elde etmek için tarayıcı ayarları da enstrümana göre değişir. Tarayıcının çözünürlük yeteneklerini en üst düzeye çıkarmak için, X-ışını ışını nokta boyutu mümkün olduğunca küçük olmalıdır (5-10 μm). Bu, X-Ray voltajı ve akım ayarlarının toplam gücü 3-4 W olacak şekilde dengelenmesiyle elde edilebilir. Bu ayarlar ve kameradaki uygun pozlama süresi ile numune ile uygun X-ışını ışını zayıflaması ve optimum görüntü kontrastı elde edilebilir. Nesne ile X-ışını kaynağı arasındaki alüminyum veya bakır filtrelerin kullanımı, en iyi görüntü kontrastı için en uygun X-ışını enerjisi ayarlarında ince ayar yapmak veya daha yüksek güçlü kaynakların kullanılması için kirişi yeterince zayıflamak için kullanılabilir. Görüntü çözünürlüğüne gelince, bu leke türü, projeksiyon görüntüsü sayısı, görüntü piksel boyutu, kamera konumu, numune hareketi, tarayıcı titreşimleri ve yeniden yapılandırma parametreleri dahil olmak üzere birçok farklı değişkene bağlı olacaktır. Bilinen boyut işaretçilerini içeren bir çubuk desen hayaleti (QRM GmbH), belirli bir tarayıcı ve kamera ayarı için uzamsal çözünürlüğü değerlendirmeye yardımcı olabilir.
Ayrıca kritik nokta kurutulmuş veya hidratlı örnekleri görüntülemenin yararlarını değerlendirmeye değer. Sombke ve ark. iki yöntemin karşılaştırmalı bir değerlendirmesini yaptı ve eklembacaklıları içeren μ-CT uygulamaları için kritik nokta kurutmanın üstün olduğunu buldu30. Bununla birlikte, hidratlı örneklerin yararları, hayvanların hem nicel hem de morfolojik eserlere yol açabilecek daha az kimyasal ve mekanik maruziyete maruz kalmasıdır. Bu aynı zamanda hassas dokuları CPD'den daha iyi koruma eğilimindedir. Bununla birlikte, hidratlı numuneler çok daha kısa bir raf ömrüne sahiptir ve doku bozulması ve düşük görüntü kalitesi bu noktada belirgin hale geldiğinden, fiksasyondan en geç bir ay sonra görüntülenmelidir. Ayrıca, hidratlı numunelerin çözünürlüğü kritik bir nokta kurutulmuş numuneden biraz daha az olacaktır, çünkü X ışınları hem plastik pipet ucuna hem de çevredeki sıvıya (su veya tampon) nüfuz etmelidir. Kritik Nokta Kurutulmuş numuneler, özellikle Drierite'de tutulduğunda çok daha uzun süre korunabilir. Ayrıca, kanatları veya bacakları bir böcek pimine yapıştırarak ve montaj işlemini basitleştirerek sahne aynasına yerleştirerek doğrudan X-ışını ışını yoluna yerlenebilirler. Bununla birlikte, bu örneklerin geniş etanol dehidrasyonu doku büzülmesine ve hassas doku mimarisinin kaybına yol açabilir, bu nedenle bu etkileri en aza indirmek için bir dizi artan EtOH konsantrasyonu yapmak önemlidir. Bununla birlikte, paraformaldehit fiksasyonu ve hatta iyot lekelenmesi de dahil olmak üzere her türlü kimyasal tedavinin doku büzülmesine neden olabileceği belirtilmelidir58,59. Her iki yöntem de canlı bir sinekte 'gerçek organ büyüklüğü' ölçümleri sağlamazken, sabitleme, boyama ve kurutma adımları her iki numune kümesi için de aynı şekilde gerçekleştirildiği sürece mutant ve wildtype hayvanları karşılaştırırken morfometrik ölçümler hala geçerlidir ( tercihen paralel olarak).
Sonuç olarak, μ-CT Drosophila33 , 34 , 35,36,37,38,39,40,41için yararlı bir tüm hayvan görüntüleme aracı sağlar. Diğer birçok çalışma, böcek taksonomisi, ekoloji, fizyoloji, gelişim ve anatominin sineklerde gelecekteki çalışmaları bilgilendirmeye yardımcı olabilecek çeşitli yönlerini anlamak için bu teknolojinin gücünü sergilemiştir1,28,30,31,32,55,56,57 . Bu organizmada zaten yaygın olarak kullanılan genetik ve hafif mikroskopi araçlarıyla birlikte, μ-CT, genotip ve fenotip arasında daha derin bir anlayışa izin veren deneysel bir boru hattı içinde kendini konumlandırabilir.

Bir nesnenin iç yapılarının genel 3D mimarisini tahrip etmeden ayrıntılı olarak araştırılmasına izin veren görüntüleme yöntemlerinin fizik, mühendislik, malzeme bilimi, arkeoloji, paleontoloji, jeoloji ve biyoloji 1 ,2,3, 4 ,5,6,7,8,9 dahil olmak üzere bir dizi farklı disipline yaygın olarak yararlı olduğukanıtlanmıştır. . Bu tahribatsız görüntüleme yöntemleri arasında, X-ışını tabanlı platformlar, özellikle yüksek enerjili X ışınlarının görünür ışık dalgalarına kıyasla çok farklı numune türlerine ve malzemelere minimum saçılma ile nüfuz edebilmesi nedeniyle yararlıdır. Bilgisayarlı Tomografi (BT), Mikro bilgisayarlı Tomografi (μ-CT), Nanocomputed Tomografi (Nano-CT) ve Synchrotron Mikrotomografisi, milimetreden mikrona kadar değişen örneklerin X-ışını tabanlı görüntüleme için birincil teknolojiler olarak ortaya çıkmıştır, milimetre ila mikron altı çözünürlük yetenekleri10,11,12,13,14.
Bu platformlar, numune boyutunu ve çözünürlüğünü dengelemek için tasarımlarında, X-ışını geometrilerinde ve bileşenlerinde farklılık gösterse de, hepsi görüntü yakalama için aynı temel ilkeye dayanır: nesnenin içinden geçen ve bir dedektör tarafından yakalanan bir X-ışın kaynağı. Nesne içindeki farklı yoğunluklardan geçerken X-ışını ışınının diferansiyel zayıflaması görüntü kontrastı oluşturur. 3B veriler, numune veya dedektör döndürülerek, daha sonra algoritmalar kullanılarak yeniden yapılandırılan bir dizi 2B projeksiyon görüntüsü toplanarak x,y,z15'teçözünürlüğü izotropik olan 3B bilgileri içeren tomogramlara toplanır. Görüntülenmekte olan nesneye X ışınları yansıtmak için koni ışını X-ışını geometrisi kullanan birçok tezgah üstü μ-CT tarayıcı için, Feldkamp algoritması nesneyi en az hatayla doğru bir şekilde yeniden oluşturmak için kullanılır16.
Belirli bir platformun çözünürlüğü öncelikle X-ışını ışınının boyutu (spot boyutu), tarayıcı geometrisi (nesneden X-ışını kaynağına uzaklık), dedektördeki piksellerin boyutu ve kullanılan yeniden yapılandırma algoritması gibi sistem parametrelerine göre belirlenir. Tarayıcı titreşimleri, X-ışını ışını dalgalanmaları, numune hareketi ve malzeme tipi veya nesneyi görselleştirmek için kullanılan kimyasal leke gibi ek faktörler de gerçek dünya görüntüleme çeşnileri altında mekansal çözünürlüğü önemli ölçüde etkileyebilir15.
Biyomedikal uygulamalar için BT ve μ-CT anatomi, fizyoloji, gelişim ve hastalık mekanizmaları anlayışımızı geliştirmede kilit rol oynamış, hem insan hasta tanıları için bir araç hem de model organizmalar için preklinik görüntüleme platformu olarak hizmet vermektedir17,18. Örneğin, amacı fare genomundaki her genin işlevini tanımlamak olan Mouse International Phenotyping Konsorsiyumu, fenotipleme boru hattı19'unbir parçası olarak μ-CT kullanır. Sonuçları, gelişim ve hastalık süreçlerinde yer alan genleri anlamak için kritik öneme sahipken, fare anatomisi ve gelişimi için bir atlas görevi degörür 20. Zebra balıkları ve sıçanlar gibi diğer model organizmalar da, bir dizi gen mutantının tüm hayvan fenotiplemesini gerçekleştirmek için μ-CT kullanımını tamamen benimsemiş17,21,22,23.
Tüm hayvan görüntülemeyi model organizmalarla birleştirmenin avantajı, belirli bir biyolojik süreç için gen fonksiyonunun mekanistik bir anlayışının tam olarak araştırılabilmesidir. Bu, iyi karakterize edilmiş genomlar ve farklı gelişimsel zaman noktalarında, belirli dokularda, bireysel hücrelerde ve hatta hücre altı organellerde gen fonksiyonunun hassas bir şekilde manipüle olmasına izin veren model organizmalarda bulunan birçok genetik araç nedeniyle mümkündür. Bunlar UAS/GAL4 sistemi (ve birçok türevi), CRISPR/Cas9 ve RNAi24 , 25,26gibi ikili ifade sistemlerini içerir. Bu genetik araçlar elektron mikroskopisi, ışık mikroskopisi (floresan ve floresan olmayan) ve μ-CT gibi tüm hayvan görüntülemeden oluşan güçlü bir görüntüleme boru hattı ile birlikte kullanıldığında, moleküllerin, hücrelerin, dokuların, organların ve tüm organizmanın kapsamlı bir değerlendirmesi elde edilebilir ve bu da gen fonksiyonunun çok daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlar.
Bu protokol, sayısız genetik aracı çok sayıda moleküler mekanizmanın aydınlatılmasına yardımcı olan memeli olmayan model organizma Drosophila melanogaster'da μ-CT kullanımına odaklanmaktadır26,27. Model olmayan böcekler1 , 28 ,29,30,31,32'deki önceki protokollerden benimsendi ve bu hayvanda kullanımı için standartlaştırılmış bir protokol oluşturmak için Drosophila'daki önceki μ-CT çalışmalarından yola çıktı33,34,35,36,37,38,39 ,40,41. Ticari olarak kullanılabilen tarayıcılar kullanılarak fly μ-CT veri kümelerinin başarılı bir şekilde numune hazırlanması, görüntülenmesi ve analizi için adımlar özetlenmiştir. Bu protokol ile, sineğin tüm gelişim aşamaları taksonomi, anatomi, gelişim, fizyoloji ve hastalık dahil olmak üzere hem tanımlayıcı hem de hipotez testi çalışmaları için yüksek çözünürlükte görselleştirilebilir27. Bu protokol, μ-CT ile görselleştirmeyi geliştirmek için görüntü kontrastı için kimyasal boyama gerektiren hemen hemen her böcek ve hatta canlı olmayan malzemeleri görüntülemek için de yararlı olacaktır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For critical point drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#39;s Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT10132</td>
			<td>For animal fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dragonfly Software</td>
			<td>Object Research Systems</td>
			<td></td>
			<td>For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For microfuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine Solution (I2KI)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SI86-1</td>
			<td>For staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcomputed Tomography Scanner</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Skyscan 1172</td>
			<td>Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 &#181;m pixel size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcomputed Tomography Scanner Software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-15</td>
			<td>For poking hole in cuticle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRecon Image Reconstruction Software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipet tips</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-120</td>
			<td>Sample mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Resarch Products International</td>
			<td>P32060-4000.0</td>
			<td>Dilute to 1X with water before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic Acid Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79690-25g</td>
			<td>For staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26018-17</td>
			<td>For Minutien Pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>111036</td>
			<td>To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Ray Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Xradia 520 Versa</td>
			<td>Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD&#8482;)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole animal imaging of drosophila melanogaster using microcomputed tomography

Biyomedikal görüntüleme araçları, genlerden organizmalara kadar mekansal ölçeklerde moleküler mekanizmaların araştırılmasına izin vermektedir. İyi karakterize edilmiş bir model organizma olan Drosophila melanogaster, hücre ve doku düzeyinde gen fonksiyonunu anlamak için ışık ve elektron mikroskopisi kullanımından yararlanmıştır. Tüm bozulmamış organizma düzeyinde gen fonksiyonunun anlaşılmasını sağlayan görüntüleme platformlarının uygulanması, genetik mekanizmalar hakkındaki bilgimizi daha da artıracaktır. Burada, mikro bilgisayarlı tomografi (μ-BT) kullanarak Drosophila'yı herhangi bir gelişim aşamasında görselleştirmek için gereken adımları özetleyen bir hayvan görüntüleme yöntemi sunulmaktadır. μ-CT'nin avantajları arasında, doku diseksiyonu veya temizleme yöntemlerine gerek kalmadan mikron düzeyinde çözünürlükte doğru 3D bilgi üretmek için piyasada bulunan enstrümantasyon ve minimum uygulamalı zaman bulunur. Görüntü analizi ve 3D işlemeyi hızlandıran yazılımlarla eşleştirilmiş, hem tanımlayıcı hem de hipotez test çalışmaları için gelişim, fizyoloji ve anatomi mekanizmalarını daha iyi anlamak için herhangi bir doku veya organ sisteminin ayrıntılı morfometrik analizi yapılabilir. Elektron mikroskopisi, ışık mikroskopisi ve μ-CT kullanımını içeren bir görüntüleme iş akışı kullanılarak, gen fonksiyonunun kapsamlı bir değerlendirmesi yapılabilir, böylece bu güçlü model organizmanın yararlılığı daha da arttırılabilir.

Şekil 2'de bir embriyonun, 3rd instar larvalarının, faz yetişkin aşamasındaki (P7) pupaların ve ticari bir tezgah üstü tarayıcı kullanılarak iyotla boyanmış ve suda nemlendirilmiş yetişkin bir dişi sineğin görüntüleri gösterilmiştir. Hassas dokunun mükemmel korunması ve hatta boyanmaları belirgindir, bu da tüm ana organların kolayca tanımlanmasını ve morfometrik analiz ve 3D görselleştirme için kullanılmasını sağlar.
Tipik olarak, numunenin daha az projeksiyon görüntüsü elde eden taramalar, daha fazla projeksiyon görüntüsü elde eden taramalardan daha düşük çözünürlük sağlar ve takas tarama için harcanan zamandır. Tarama süreleri enstrümana ve diğer tarama parametrelerine göre değişse de, birkaç yüz projeksiyon (~3 μm görüntü piksel boyutu) elde eden taramalar numune başına yaklaşık 30 dakika süre alırken, binlerce projeksiyon görüntüsünden (700 nm-1,25 μm görüntü piksel boyutu) oluşan taramalar 8-16 saat sürebilir. Şekil 3'tehem 'yavaş' (binlerce projeksiyon) hem de 'hızlı' (yüzlerce projeksiyon) tarama modunda çekilen aynı yetişkin sinek başlığının karşılaştırması gösterilmiştir. Daha da önemlisi, morfometrik analizler 'yavaş' ve 'hızlı' taramalar arasında farklılık gösterir (Şekil 3C)40. Bu nedenle görüntüleme boru hattımız, morfometrik analiz için yeterince büyük bir örnek boyutu oluşturmak için hızlı taramalar ve daha yüksek çözünürlükte morfolojik veya anatomik kusurları görselleştirmek için yavaş taramalar kullanır. Yazılımı kullanarak (Adım 7), ilgi çekici herhangi bir doku veya organ sistemi bölümlerek morfometrik analiz için kullanılabilir ve film yapımcısı (Film 1) kullanılarak 3D olarak görselleştirilebilir.
Şekil 4, PTA ile boyanmış sinek karnının bir örneğini gösterir ve görüntülenmiş hidratlı (su) veya bir X-ışını mikroskobundaki (Malzeme Tablosu) kritik nokta kurutmasını (CPD)takip eder. PTA'nın bir kombinasyonu ve bu platformun yetenekleri tarafından sağlanan ayrıntı, bu görüntülerde kolayca belirgindir, böylece testislerdeki midgut ve sperm demetlerinin bireysel epitel hücreleri kolayca çözülür. CPD görüntüsü hidratlı örneğe kıyasla marjinal olarak artmış çözünürlük gösterirken, hassas dokuların (kütikül yakınındaki yağ hücreleri gibi) ultrayapısının daha iyi korunması hydrated örneklerle elde edilir (Film 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig01.jpg"> Şekil 1: μ-CT için tarayıcı tasarımına ve örnek montajına genel bakış. (A) Ticari tezgah üstü μ-CT tarayıcı. (B) Tarayıcının içini görüntüleyin. X-ışını kaynağı (sağda), dönen bir aşamada (sarı ok) bulunan numuneden geçen X-Ray'ler yayar. Bu X ışınlarının zayıflaması, numuneden geçerken ve X ışınlarını fotonlara dönüştüren bir scintillation ekranından ve standart bir CCD kameradan (solda) oluşan dedektöre geçerken görüntü kontrastı oluşturur. (C) Suda hidratlı görüntüleme için yetişkin bir meyve sineği monte etmek. Pipet ucu ile pirinç tutucu arasındaki bağlantı noktaları, sızıntıyı ve tarayıcının potansiyel hasarını önlemek için parafin filmine sarılır. Sahne aynası da vurgulanır. Pipet ucunun biraz eksen dışı konumlandırıldığını ve bu da son rekonstrüksiyonda daha uzun bir tarama süresine ve daha az çözünürlüğe yol açtığını unutmayın. (D) Yetişkin bir dişi sineğin tek bir 2D projeksiyon görüntüsü; bu projeksiyonların yüz ila binlercesi dönme ekseni boyunca bir tarama sırasında elde edilir ve izotropik çözünürlük ve doğru 3D bilgiler içeren tomogramlar oluşturmak için yeniden yapılandırma için kullanılır. Ölçek Çubukları (C) = 2 mm. P, Posterior; V, Ventral. Bu rakam Schoborg ve ark.40'dan değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig02.jpg"> Şekil 2: Tüm Drosophila melanogaster yaşam döngüsü aşamaları, μ-CT tarafından görüntülenmiştir. İyotla boyanmış ve suda nemlendirilmiş görüntüler. Gösterilen tek bir 2D dilimdir. (A) Gastrülasyonun erken aşamalarını tamamlamış bir embriyo (yıldız). (B) Üçüncü bir başlangıç larvası. (C) Metamorfoz sırasında bir P7 faz yetişkin. (D) Yetişkin bir kadın. Çeşitli organlar vurgulanır: BWM, vücut duvarı kasları; Br, beyin; Cd, cardia; Cr, kırpma; DLM'ler, dorsal boyuna kaslar; DVM, dorsal ventral kaslar; E-AD, göz antenli disk; Em, embriyo; FB, yağ gövdeleri; FBC'ler, yağ vücut hücreleri; H, kalp; Hg, arka ayak; La, lamina; L, bacak; Mg, midgut; OL, beyin optik lob; Ov, ovipositor; PC, pupal manikül; SG, tükürük bezleri; VNC, ventral sinir kordonu; W, kanat; WD, kanat diski. Ölçek Çubukları (A) = 100 μm; (B)-(D) = 500 μm. D, Dorsal; A, Ön; L, sola. Tarama parametreleri: Kaynaktan Numuneye Mesafe (mm): (A, D) 36.5, (B) 48.8, (C) 40.3. Kaynaktan Kameraya Uzaklık (mm): (A, D) 350, (B, C) 285. Kamera Piksel Boyutu (μm): (A-D) 11.6. Görüntü Piksel Boyutu (μm): (A, D) 1.2, (B) 1.9, (C) 1.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig03.jpg"> Şekil 3: Tarama parametreleri ve görüntü çözünürlüğü morfometrik analizleri değiştirmez. Yetişkin kafası hem (A, A') 'hızlı' tarayıcı ayarları (yüzlerce projeksiyon) ve (B, B') 'yavaş' tarayıcı ayarları (binlerce projeksiyon) kullanılarak tarandı. Beyin sarı ile özetlenmiştir. (C) Yavaş ve hızlı taramalardan beyin hacmi ölçümleri. Vurgulanan yapılar: AL; anten lob; CB, merkezi beyin; FB, fan şeklinde gövde; FCS, yağ hücreleri; La, lamina; Lo, lobula; LoP, lobula plaka; Ben, medulla; Tekrar, retina. n = 5, Welch'in t testi. ns = önemli değil. Ölçek çubukları = 100 μm. Tarama parametreleri: Kaynaktan Numuneye Mesafe (mm): (A) 44.4, (B) 36.5. Kaynaktan Kameraya Uzaklık (mm): (A) 348 (B) 350. Kamera Piksel Boyutu (μm): (A-B) 11.6. Görüntü Piksel Boyutu (μm): (A) 2.95, (B) 1.2. Bu rakam Schoborg ve ark.40'dan değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig04.jpg"> Şekil 4: Drosophila melanogaster karın X-ışını Mikroskopisi ile görüntülenmiştir. Karınlar % 0.5 PTA ile boyandı ve görüntülenmiş hidratlı (su) veya kritik nokta kuruması (CPD) takip edildi. (A) Kritik Nokta Kurutulmuş karın, YZ perspektifinden ve (A') XZ perspektifinden gösterilmiştir. (B) YZ perspektifinden ve (B') XZ perspektifinden gösterilen hidratlı karın. Çeşitli organlar vurgulanır: FC, yağ hücreleri; Hg, arka ayak; Mg, Midgut; SP, Sperm Pompası; Te, Testis. Ölçek Çubukları (A) = 250 μm. D, Dorsal; A, Ön; L, sola. Tarama parametreleri: Kaynaktan Numuneye Mesafe (mm): (A) 6.7, (B) 7. Kaynaktan Kameraya Uzaklık (mm): (A) 28 (B) 29,5. Amaç: (A-B) 4X. Görüntü Piksel Boyutu (μm): (A-B) 0.65. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Film 1: Dragonfly'daki Movie Maker kullanılarak 3D olarak işlenen üçüncü bir instar larva. Vurgulanan organlar arasında beyin (sarı), göz-antenli imaginal diskler (kırmızı), yağ gövdesi (mavi) ve vücut duvarı kasları (yeşil) bulunur. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61515/Movie_1_Revised.avi" target="_blank">Bu filmi indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Film 2: Suda görüntülenmiş örneklerin karşılaştırılması veya kritik nokta kurutmayı takip edin. %0,5 PTA ile lekelenmiş karınlar gösterilir. Her iki karın da aynı görüntü piksel boyutu ayarlarıyla (0,65 μm) tarandı. Bir dizi 2D dilim, sırt yüzeyinden başlayıp karnın ventral yüzeyinde biten bir 'Z-stack' formatında (YZ) gösterilir. Vurgulanan organlar: FC, yağ hücreleri; Mg, Midgut; SP, Sperm Pompası; Te, Testis. Tarama parametreleri: Kaynaktan Numuneye Mesafe (mm): (A) 6.7, (B) 7. Kaynaktan Kameraya Uzaklık (mm): (A) 28 (B) 29,5. Amaç: (A-B) 4X. Görüntü Piksel Boyutu (μm): (A-B) 0.65. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61515/Movie_2_Revised.avi" target="_blank">Bu filmi indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography at JoVE.com

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Mikro bilgisayarlı tomografi kullanılarak gelişimin herhangi bir aşamasında bozulmamış Drosophila melanogaster'ın görselleştirilmesine izin veren bir protokol sunulmaktadır.

Mikro bilgisayarlı Tomografi kullanılarak Drosophila melanogaster'ın Tüm Hayvan Görüntülemesi

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

whole-animal-imaging-drosophila-melanogaster-using-microcomputed

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

4.7K Görüntüleme.  University of Wyoming. Mikro bilgisayarlı tomografi kullanılarak gelişimin herhangi bir aşamasında bozulmamış Drosophila melanogaster'ın görselleştirilmesine izin veren bir protokol sunulmaktadır.

Video: Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Gelişim Biyolojisi

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Meyve Fly Yetiştirme<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Aksenik ve gnotobiyotik Koşullarında

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. This morphological alteration is also recognized as epithelial to mesenchymal transition (EMT). Dysregulation of EMT is associated with fibrosis and cancer metastasis. There is emerging evidence that EMT is controlled by a number of molecular mechanisms. As such, many key genes that control apical constriction are also known to be important factors in the EMT observed in cancer metastasis. Like EMT during Drosophila gastrulation, epithelial cells can be induced to change their shape and be reprogrammed to redirect cell fate towards various other cell types. Here we provide a robust imaging method of Drosophila gastrulation to assay the initiation of morphogenetic cellular movements and cell fate identification during this stage of embryonic development. Using this method, we identify cell rearrangement at the time of gastrulation and demonstrate the importance of apical constriction during gastrulation using GFP labeled DE-cadherin.

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Herein we describe a procedure to capture live images of Drosophila gastrulation. This has enabled us to better understand the apical constriction involved in early development and further analyze mechanisms governing cellular movements during tissue structure modification.

Hücre Şekli Alteration ve Hücre Hareketi Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Gastrulasyon kullanarak DE-kaderin Muhabir Transgenik Sinekler

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Çözdürme, kültür ve Drosophila hücre hatları Cryopreserving

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

Drosophila melanogaster endokrin bozulma test yöntemleri

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Drosophila melanogaster Kan-beyin Bariyer Bütünlüğü için Tahse

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged molecules within complex biological samples. While traditional confocal microscopes allow one to resolve two adjacent fluorescent point sources located a few hundred nanometers apart, observing the finer details of subcellular biology requires the ability to resolve signals in the order of tens of nanometers. Numerous hardware-based methods for super-resolution microscopy have been developed to allow researchers to sidestep such resolution limits, although these methods require specialized microscopes that are not available to all researchers. An alternative method for increasing resolving power is to isotropically enlarge the sample itself through a process known as expansion microscopy (ExM), which was first described by the Boyden group in 2015. ExM is not a type of microscopy per se but is rather a method for swelling a sample while preserving the relative spatial organization of its constituent molecules. The expanded sample can then be observed at an effectively increased resolution using a traditional confocal microscope. Here, we describe a protocol for implementing ExM in whole-mount Drosophila embryos, which is used to examine the localization of Par-3, myosin II, and mitochondria within the surface epithelial cells. This protocol yields an approximately four-fold increase in sample size, allowing for the detection of subcellular details that are not visible with conventional confocal microscopy. As proof of principle, an anti-GFP antibody is used to distinguish distinct pools of myosin-GFP between adjacent cell cortices, and fluorescently labeled streptavidin is used to detect endogenous biotinylated molecules to reveal the fine details of the mitochondrial network architecture. This protocol utilizes common antibodies and reagents for fluorescence labeling, and it should be compatible with many existing immunofluorescence protocols.

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Here, a protocol for the implementation of expansion microscopy in early Drosophila embryos to achieve super-resolution imaging using a conventional laser-scanning confocal microscope is presented.

Süper Çözünürlüklü Görüntüleme için Tam Montajlı Drosophila Embriyolarını Fiziksel Olarak Büyütmek için Genişleme Mikroskobunun Kullanılması

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larvalarından Canlı Beyin Eksplantlarının Görüntülenmesi

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Yazar Gündemi: Asimetrik Hücre Bölünmesi Dinamiğinin Araştırılması: Drosophila Larva Beyin Eksplantlarının Canlı Görüntülenmesi İçin Bir Protokol 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...