Niente di tutto questo sarebbe stato possibile senza il sostegno di Nasser Rusan. Vorrei ringraziare H. Doug Morris, Danielle Donahue e Brenda Klaunberg del NIH Mouse Imaging Facility e Ben Ache di Micro Photonics per la formazione e l'utile discussione. Ringrazio anche Mansoureh Norouzi Rad di Zeiss per aver scansionato campioni di addome su Xradia 520 Versa. Lauren Smith, Samantha Smith e Rachel Ng hanno anche aiutato con la scansione. Mike Marsh di Object Research Systems ha fornito supporto tecnico a Dragonfly. Sono anche grato per il sostegno del National Heart, Lung, and Blood Institute (1K22HL137902-01) e dei fondi start-up dell'Università del Wyoming. Ringrazio anche i revisori anonimi per i loro utili suggerimenti e commenti.

1. Selezione del campione e preparazione delle cuticole
<ol><li>Scegli il punto temporale di sviluppo appropriato (embrione, larva, pupa o adulto) per l'imaging.<ol>
<li>Per le fasi embrionali, ingabbiare le femmine su piastre di agar di succo d'uva imbrattate con pasta di lievito e raccogliere uova ogni 30-60 minuti. Lasciare che questi embrioni si sviluppino a 25 °C fino a raggiungere lo stadio corretto.</li>
		<li>Per gli stadi larvali, raccogliere il primo e il secondo instars da esperimenti di raccolta di embrioni a tempo. Scegli direttamente 3° instars erranti dal lato della fiala di cibo in condizioni di non affollamento.</li>
		<li>Per il tempismo pupale, raccogli pre-pupe bianche (spiracoli invertiti) e prendi nota del momento in cui la cuticola inizia a dorare. Gli animali progrediranno attraverso 15 fasi dello sviluppo della pupa in punti temporali definiti dopo l'imbrunimento delle cuticole e possono essere raccolti di conseguenza42.</li>
		<li>Raccogliere gli adulti come vergini dopo l'eclosione e lasciare invecchiare in una fiala alimentare per un periodo di tempo richiesto (ad esempio, 5 giorni per lo sviluppo completo dell'intestino).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire 5-50 animali in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL contenente 1 mL di Triton X-100 allo 0,5% in 1x Soluzione Salina Tamponata con Fosfato (0,5% PBST). Mentre si picchietta periodicamente il tubo sul banco, incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) per aiutare nella rimozione del rivestimento idrofobo e consentire agli animali di immergersi completamente.<ol>
<li>Per gli stadi embrionale, larvale e pupale, arrestare l'ulteriore sviluppo posizionando il tubo in un blocco di calore impostato a 100 ° C per 20 s seguito da raffreddamento a RT per 5 minuti. NOTA: Gli animali possono anche essere congelati in azoto liquido37.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fissazione e colorazione
<ol><li>Rimuovere lo 0,5% di PBST e aggiungere 1 mL di soluzione bouin. Tocca il tubo per garantire che gli animali siano completamente sommersi. ATTENZIONE: Bouin's Solution contiene formaldeide. Può causare tossicità acuta per la pelle e gli occhi se versato e può essere fatale se ingerito. Indossare guanti, occhiali di sicurezza e un cappotto da laboratorio durante la manipolazione. NOTA: Possono essere impiegate anche tecniche di fissazione aggiuntive, come l'uso di etanolo. I meriti di altri fissativi sono descritti in dettaglio nel rif.1,30.<ol>
<li>Per campioni di embrioni e adulti, incubare sul banco per 16-20 ore a RT.</li>
		<li>Per i campioni larvali e pupali, fissare gli animali per 2 ore a RT. Scartare la soluzione di Bouin e lavare con 1x PBS per 5 minuti tre volte. Trasferire in un piatto di dissezione multi-pozzo contenente 1x PBS e utilizzare un piccolo perno minuzioso attaccato a un supporto per praticare un foro nella cuticola anteriore e posteriore facendo attenzione a non interrompere alcun tessuto molle sottostante.</li>
		<li>Trasferire campioni larvali e pupali in un tubo di microfuga e aggiungere 1 mL di soluzione fresca di Bouin. Incubare su banco per 24 ore a RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di Bouin e lavare il campione per 30 minuti con 1 mL di tampone di lavaggio μ-CT (0,1 M Na2HPO4,1,8% saccarosio) o 1x PBS tre volte.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL della soluzione colorante appropriata e incubare sul banco per 2-7 giorni. NOTA: la scelta della macchia dipenderà da molti fattori, ma è generalmente un equilibrio tra penetrazione, tempo di incubazione e risoluzione. In generale, l'acido fosfotungstico (PTA) fornisce un contrasto e una risoluzione superiori dei tessuti molli, ma richiede un'interruzione meccanica della cuticola e tempi di incubazione più lunghi. I pregi dei diversi tipi di macchia sono descritti in dettaglio nel rif.1.<ol>
<li>Per la colorazione dello iodio, utilizzare 1 mL di 0,1 N I2KI (Lugol Solution). Incubare per 2 giorni. Non è necessaria alcuna ulteriore interruzione della cuticola adulta.</li>
		<li>Per la colorazione dell'acido fosfotungstico (PTA), utilizzare 1 mL di una soluzione allo 0,5% (p/v) diluita in acqua. Interrompere la cuticola adulta, rimuovendo le parti della bocca o facendo dei buchi nel torace o nella cuticola addominale con un piccolo perno di minuzie attaccato a un supporto. Incubare per 5-7 giorni o più a lungo se la colorazione dei tessuti appare non omogenea.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavare con 1 mL di acqua ultrapura o 1x PBS per 30 min. Ripetere il passaggio di lavaggio. Conservare gli animali a RT in acqua ultrapura o 1x PBS per un massimo di un mese.</li>
	<li>Se gli animali devono essere scansionati mentre sono idratati, procedere direttamente al paragrafo 4. Se è necessaria una conservazione più lunga del campione, procedere alla sezione 3 del protocollo.</li>
</ol>3. Asciugatura del punto critico (opzionale)
<ol><li>Eseguire una serie di disidratazione a etanolo (EtOH) sul campione: 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 100%. Aggiungere 1 mL della soluzione etOH e incubare sul banco per 1 ora per ogni concentrazione nell'ordine indicato.</li>
	<li>Dopo l'ultimo ammollo 100% EtOH, sostituire con etOH fresco al 100% e lasciare incubare il campione sul banco durante la notte.</li>
	<li>Eseguire l'essiccazione dei campioni in punto critico seguendo le istruzioni del produttore. NOTA: Gli impianti di microscopia elettronica hanno generalmente una macchina per l'essiccazione del punto critico (vedi Tabella dei materiali)che eseguirà l'essiccazione del campione dopo la disidratazione dell'EtOH.</li>
</ol>4. Montaggio del campione
<ol><li>Per i campioni essiccati in punto critico, campioni di colla a caldo su un perno di insetto o altro supporto progettato per adattarsi al mandrino dello stadio rotante o posizionarlo in un tubo capillare di plastica o vetro (~ 1,0-1,25 mm di diametro interno).</li>
	<li>Per i campioni idratati, riempire una punta della pipetta P10 con acqua e fissare l'estremità stretta sigillando termicamente o con un film di paraffina per evitare perdite. ATTENZIONE: Assicurarsi di avvolgere saldamente le connessioni in modo che l'acqua non perda nello scanner e causi danni.<ol>
<li>Trasferire un singolo campione sulla punta della pipetta usando una pinna. Utilizzando un oggetto lungo e snello, come un ago da 20 G opaco o un'altra punta della pipetta, spingere con attenzione il campione verso il basso la punta fino a quando non contatta la parete della punta del pipetto per tenerlo in posizione.</li>
		<li>Coprire l'apertura della punta della pipetta con un film di paraffina per evitare l'evaporazione dell'acqua durante le scansioni lunghe.</li>
		<li>Montare la pipetta P10 utilizzando un supporto progettato per adattarsi al mandrino dello stadio rotante (Figura 1A-C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Scansione
<ol><li>Eseguire tutte le calibrazioni necessarie della macchina prima dell'imaging per la giornata. NOTA: questi variano a seconda del produttore e si consiglia di consultare uno specialista dell'applicazione per determinare i passaggi corretti. Si prega di consultare la Tabella dei materiali per informazioni specifiche sulla configurazione e sul software utilizzato in questo protocollo. Generalmente, calibrazioni come l'allineamento dell'asse dello stadio per rimuovere qualsiasi "oscillazione" associata al mandrino fuori asse rispetto allo stadio rotante ed eseguire correzioni a campo piatto per garantire intensità uniformi dei pixel di sfondo sulla fotocamera forniscono condizioni di imaging ottimali per la migliore risoluzione e set di dati comparabili tra più scansioni.</li>
	<li>Aprire lo sportello dello scanner per accedere al mandrino dello stadio rotante facendo clic sull'icona 'Apri porta' nell'angolo in alto a sinistra del software. Attaccare il campione stringendo il collare attorno alla base del portase campioni. NOTA: utilizzare una pressione delicata quando si collega il campione al mandrino rotante per mantenere l'allineamento dello scanner.</li>
	<li>Impostare i parametri di scansione nel software che controlla lo scanner per una risoluzione e un contrasto ottimali. NOTA: questi dovranno essere determinati empiricamente poiché la sorgente di raggi X, la fotocamera / rilevatore e la geometria di ciascun scanner varieranno in base al produttore. Ulteriori informazioni per selezionare i migliori parametri sono disponibili anche qui43, nonché dallo specialista delle applicazioni del produttore.<ol>
<li>Aprire il controllo di alimentazione della sorgente a raggi X (Opzioni | Sorgente di raggi X). Utilizzare le barre di scorrimento per impostare la tensione dei raggi X su 30-40 kV e la corrente su 100-110 μA per produrre un fascio di raggi X con 3-4 W di potenza e una dimensione dello spot ridotta per una maggiore risoluzione.</li>
		<li>Utilizzare la finestra di dialogo Modalità di acquisizione (Opzioni | Modalità di acquisizione) per impostare il tempo di esposizione della fotocamera a 500-800 ms.</li>
		<li>Utilizzare la barra di scorrimento situata accanto all'icona della lente di ingrandimento nella parte inferiore del software per impostare la dimensione dei pixel dell'immagine desiderata (~ 700 nm a 4 μm), a seconda delle impostazioni e della posizione della fotocamera. Questo determina il numero di immagini di proiezione che vengono acquisite durante la scansione, con più proiezioni che portano a una risoluzione migliorata ma tempi di scansione più lunghi (vedere Risultati rappresentativi).</li>
		<li>Fare clic e trascinare la barra di scorrimento situata accanto alla freccia rotante nella parte inferiore del software per spostare il campione lungo il percorso di rotazione a 360 °. Assicurarsi che l'esempio rimanga all'interno del campo visivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fare clic sull'icona'Avvia acquisizione'(icona a forma di freccia circolare blu) nella parte superiore del software. Viene visualizzata una finestra di dialogo che consente di impostare parametri di scansione aggiuntivi e di nominare il file e la cartella di output in cui verrà salvata la scansione.<ol>
<li>Imposta il movimento casuale su 10 e una media di 4-6 fotogrammi. La fase di rotazione viene calcolata automaticamente in base alle impostazioni della telecamera utilizzate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inizia la scansione facendo clic su 'OK' nella finestra di dialogo Acquisizione. Viene visualizzata una seconda finestra di dialogo della barra di avanzamento che mostra il tempo di scansione. Lo scanner acquisirà ora una serie di immagini di proiezione (Figura 1D) del campione lungo il percorso di rotazione e non ha bisogno di essere monitorato.</li>
</ol>6. Ricostruzione
<ol><li>Per generare i tomogrammi, eseguire la ricostruzione dell'immagine utilizzando le immagini di proiezione. NOTA: Mentre quasi tutte le ricostruzioni di immagini da scanner geometrici a fascio cono si basano sull'algoritmo Feldkamp16,i singoli parametri variano a seconda dell'implementazione del software e devono essere determinati empiricamente. Le seguenti impostazioni, specifiche per un software disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali)possono essere utilizzate come guida. Parametri come la compensazione del disallineamento, la riduzione dell'artefatto dell'anello e la correzione dell'indurimento del fascio (0% per la maggior parte dei campioni di mosca) vengono eseguiti in modo iterativo per scegliere i valori migliori per la ricostruzione finale. Per gli utenti esperti che desiderano un maggiore controllo sul processo di ricostruzione, vedere l'interfaccia MATLAB qui44.</li>
	<li>Eseguire un allineamento iniziale dell'immagine utilizzando un algoritmo di correzione dello spostamento basato sulle scansioni di riferimento45 (Azioni | Allineamento X/Y con scansione di riferimento).
</li>
	<li>Ottimizza ogni parametro di ricostruzione (Start | Messa a punto). In questo modo viene attivata una finestra di dialogo "Ottimizzazione dei parametri".<ol>
<li>Ottimizza l'allineamento facendo clic su 'Avanti' a 'Post-allineamento'. Impostare il numero di iterazioni su cinque e il passaggio del parametro su 1.0. Fare clic sul pulsante Start per generare una serie di anteprime. Selezionare l'immagine correttamente allineata. NOTA: un'immagine correttamente allineata non sarà sfocata o visualizzerà artefatti di "taglio" in cui appare divisa una struttura altrimenti continua (come la cuticola).</li>
		<li>Ottimizza la riduzione dell'artefatto dell'anello facendo clic accanto ad esso. Impostare il numero di iterazioni su cinque e il passaggio del parametro su 1.0. Fare clic sul pulsante Start per generare una serie di anteprime. Selezionare l'immagine che contiene il minor numero di anelli.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una volta che i parametri di cui sopra sono stati ottimizzati per dare l'immagine migliore, assicurarsi che i valori selezionati siano rappresentati correttamente nella scheda Impostazioni (Impostazioni).
</li>
	<li>Regola i valori finali di luminosità e contrasto utilizzando l'istogramma, i parametri del file come la profondità di bit e il tipo e utilizza una regione di interesse (ROI) che comprende solo le strutture di interesse (ad esempio, solo l'intera mosca o la testa) per ridurre il tempo di calcolo(Output).</li>
	<li>Inizia la ricostruzione (Start | Inizio). Se sono necessarie più ricostruzioni, aggiungere l'immagine corrente al gestore batch (Start | Aggiungi al batch) e ripetere i passaggi 6.2-6.5 per le immagini rimanenti.</li>
</ol>7. Analisi delle immagini
<ol><li>Visualizza i tomogrammi in due e tre dimensioni ed esegui ulteriori analisi morfometriche con software freeware o commerciale. NOTA: I dettagli del software utilizzato in questo protocollo sono disponibili nella Tabella dei materiali. Altri pacchetti software in grado di valutare set di dati μ-CT includono opzioni freeware come FIJI46, Seg3D (www.seg3D.org)47e ITK-SNAP48, oltre a software commerciale (ad esempio, AMIRA). Altre applicazioni che impiegano algoritmi basati sull'apprendimento automatico per semi-automatizzare il processo di segmentazione possono aiutare a velocizzare i flussi di lavoro e ridurre i pregiudizi umani (ad esempio, Biomedisa49).</li>
	<li>Importare il file del tomogramma nel software (File | Importa file immagine). I metadati associati al file dovrebbero caricarsi automaticamente nella finestra, ma possono anche essere impostati manualmente per corrispondere alle proprietà dell'immagine.</li>
	<li>Per segmentare una struttura di interesse, fai clic sulla scheda Segmento sul lato sinistro dello schermo. Creare una nuova regione di interesse (ROI)(| di base Nuovo), dargli un nome e selezionare un colore appropriato.</li>
	<li>Definire l'intervallo di soglia che comprende la struttura di interesse (Intervallo | Definisci intervallo) utilizzando la barra di scorrimento.</li>
	<li>Selezionare una modalità di pittura ROI 2D o 3D appropriata (ROI Painter | Opzione pennello).
</li>
	<li>Per dipingere un'area definita dalla soglia; tenere premuto il tasto Ctrl tenendo premuto il tasto sinistro del mouse. Per rimuovere un'area, tieni premuto il tasto Maiusc mentre tieni premuto il tasto sinistro del mouse. NOTA: per modificare le dimensioni del pennello circolare o quadrato, è sufficiente scorrere la rotellina del mouse tenendo premuti i tasti Ctrl o Maiusc.</li>
	<li>Continua a dipingere la struttura di interesse in tutto il suo volume Z.</li>
	<li>Convertire il ROI in una mesh (Export | A un | mesh Normale).
</li>
	<li>Evidenziare la sovrapposizione mesh facendo clic su di essa nel pannello Proprietà dati e impostazioni nell'angolo in alto a destra.</li>
	<li>Lisciare la mesh utilizzando un numero appropriato di iterazioni (Smooth Mesh | Iterazioni). NOTA: utilizzare lo stesso valore di iterazione di smussatura mesh per tutte le immagini da confrontare.</li>
	<li>Assicuratevi che le misurazioni del ROI della mesh(Superficie, Volume e Diametro Feret)siano visualizzate nel pannello Informazioni sul lato destro dello schermo per l'analisi morfometrica di base. Ulteriori analisi possono essere eseguite utilizzando il modulo di analisi degli oggetti.</li>
	<li>Eseguite il rendering dell'oggetto mesh e dell'intera immagine del tomogramma e visualizzate in 3D. Utilizzare Movie Maker integrato per generare un video dell'oggetto (fare clic con ilpulsante destro del mouse | Mostra Movie Maker) utilizzando singoli fotogrammi dal visualizzatore (Aggiungi chiave). NOTA: diversi miglioramenti visivi possono essere applicati anche al filmato utilizzando la scheda Effetti visivi nel pannello di destra per evidenziare determinate funzionalità, ecc.</li>
	<li>Esporta il video per la visualizzazione utilizzando il pulsante Esporta animazione in Movie Maker.</li>
</ol>

L'autore non dichiara interessi concorrenti o finanziari.

Visualizzare la Drosophila melanogaster intatta in tutte le fasi dello sviluppo è rimasta una sfida, principalmente a causa dell'incompatibilità della microscopia ottica con la cuticola spessa e pigmentata che si trova in questo animale. Mentre altri metodi di imaging di animali interi, come la risonanza magnetica (MRI), la tomografia a coerenza ottica (OCT) e l'ultramicroscopia accoppiata con la pulizia dei tessuti sono stati utilizzati con successo nelle mosche50,51, 52,53,54,μ-CT presenta una serie di vantaggi che lo rendono ideale per l'imaging di animali interi di questo organismo13,15,30 . I raggi X penetrano facilmente nella cuticola pigmentata e la loro piccola lunghezza d'onda consente l'imaging sub-micron. L'etichettatura richiede un investimento minimo in sostanze chimiche ampiamente disponibili e nessuna competenza da banco specializzata13. μ scanner ct sono anche disponibili in commercio e i costi sono paragonabili alle piattaforme di microscopia ottica, pur essendo più attraenti per una più ampia gamma di discipline (geologia, paleontologia, ingegneria, ecc.) che possono anche beneficiare della sua disponibilità presso un'istituzione. Le sorgenti di raggi X di sincrotrone possono anche essere utilizzate per l'imaging μ-CT ad alta risoluzione di insetti fissi e viventi31,55,56,ma sono meno accessibili degli scanner da banco commerciali.
Questo protocollo fornisce un modo efficiente per ottenere immagini μ-CT di adulti mosca, pupe, larve ed embrioni cellularizzati. Si noti che per molti dei passaggi descritti sopra, è possibile applicare anche metodi alternativi per preparare i campioni per l'imaging. Altri studi hanno fornito un confronto dettagliato di diverse fasi di fissazione, etichettatura e asciugatura per l'uso negli insetti e coloro che sono interessati ad adottare questa tecnica sono incoraggiati a valutare i meriti di ciascun approccio1,4,13,29,30,57. Mentre questo protocollo è relativamente semplice, vengono presentati alcuni suggerimenti utili.
In primo luogo, è necessario prestare attenzione quando si interrompe la cuticola di campioni intatti in modo tale che i tessuti molli sottostanti non vengano interrotti in modo significativo. È importante lasciare che le fasi larvali e le prime fasi pupali subiscano la fissazione per 2 ore nella soluzione di Bouin prima di colpire. Ciò irrigidisce il tessuto e limita la quantità di emolinfa che trasuda dai fori delle cuticole, che possono alterare l'architettura degli organi. I singoli segmenti del corpo (testa, torace e addome) dell'adulto possono essere separati se le strutture di interesse si trovano lì. Si consiglia di utilizzare un bisturi per tagliare in modo pulito questi segmenti piuttosto che separarli con una pinze, che potrebbero interrompere l'architettura 3D dell'intestino o del sistema nervoso centrale, per esempio. Per quanto riguarda i tempi, gli adulti hanno generalmente bisogno solo di 16 ore. per la fissazione completa, mentre gli stadi larvale e pupale necessitano di 24 ore. Inoltre, se la colorazione di iodio o PTA appare irregolare, il campione può essere rimesso in soluzione per incubare più a lungo fino a raggiungere una colorazione uniforme. Infine, i campioni idratati non devono essere posizionati a 4 °C, in quanto ciò sembra indurre la formazione di bolle d'aria all'interno della cavità corporea dopo il riscaldamento a temperatura ambiente.
In secondo luogo, il montaggio del campione varia in base allo strumento, al tipo di stadio e se il campione deve rimanere idratato o è stato asciugato dal punto critico. Se idratato, assicurarsi che il campione non perda ed eventualmente distrugga lo scanner. Quando si monta il campione all'interno di una punta della pipetta, assicurarsi di spingere delicatamente con un oggetto opaco fino a quando i campioni incontrano una leggera resistenza e non possono muoversi. Spingere troppo forte può portare a deformazioni della cuticola e difetti strutturali sottostanti. Inoltre, assicurarsi che il campione sia allineato nel supporto il più vicino possibile all'asse di rotazione. Qualsiasi oscillazione aumenterà i tempi di scansione a causa del campo visivo più ampio e ridurrà la risoluzione del tomogramma finale dopo la ricostruzione.
In terzo luogo, le impostazioni dello scanner per l'acquisizione di immagini di proiezione variano anche in base allo strumento. Per massimizzare le capacità di risoluzione dello scanner, la dimensione dello spot del fascio di raggi X deve essere la più piccola possibile (5-10 μm). Ciò può essere ottenuto bilanciando la tensione a raggi X e le impostazioni di corrente in modo tale che la potenza totale sia di 3-4 W. Con queste impostazioni e il tempo di esposizione appropriato sulla fotocamera, è possibile ottenere una corretta attenuazione del fascio di raggi X da parte del campione e un contrasto ottimale dell'immagine. L'uso di filtri in alluminio o rame tra l'oggetto e la sorgente di raggi X può essere utilizzato per mettere a punto le impostazioni ottimali dell'energia dei raggi X per il miglior contrasto dell'immagine o attenuare il fascio sufficientemente per utilizzare sorgenti di potenza superiore. Per quanto riguarda la risoluzione dell'immagine, questa dipenderà da molte variabili diverse, tra cui il tipo di macchia, il numero di immagini di proiezione, la dimensione dei pixel dell'immagine, la posizione della fotocamera, il movimento del campione, le vibrazioni dello scanner e i parametri di ricostruzione. Un modello di barra fantasma (QRM GmbH) contenente marcatori di dimensioni note può aiutare a valutare la risoluzione spaziale per una determinata impostazione dello scanner e della fotocamera.
Vale anche la pena valutare i meriti dell'imaging di campioni secchi o idratati a punto critico. Sombke et al. hanno eseguito una valutazione comparativa dei due metodi e hanno trovato l'essiccazione del punto critico superiore per le applicazioni μ-CT che coinvolgono artropodi30. Tuttavia, i benefici dei campioni idratati sono che gli animali sono soggetti a una minore esposizione chimica e meccanica che potrebbe portare a manufatti sia quantitativi che morfologici. Questo tende anche a preservare i tessuti delicati meglio della CPD. Tuttavia, i campioni idratati hanno una durata di conservazione molto più breve e dovrebbero essere ripresi entro e non oltre un mese dalla fissazione poiché la degradazione dei tessuti e la ridotta qualità dell'immagine diventano evidenti a quel punto. Inoltre, la risoluzione dei campioni idratati sarà leggermente inferiore a quella di un campione essiccato al punto critico, perché i raggi X devono penetrare anche attraverso una punta di pipetta di plastica e il liquido circostante (acqua o tampone). Punto critico I campioni essiccati possono essere conservati per periodi di tempo molto più lunghi, specialmente se conservati su Drierite. Possono anche essere posizionati direttamente nel percorso del fascio di raggi X semplicemente incollando le ali o le gambe a un perno di insetto e posizionandolo nel mandrino del palco, semplificando il processo di montaggio. Tuttavia, l'estesa disidratazione dell'etanolo di questi campioni può portare al restringimento dei tessuti e alla perdita di un'architettura tissutale delicata, motivo per cui è importante eseguire una serie di concentrazioni crescenti di EtOH per ridurre al minimo questi effetti. Tuttavia, va notato che tutte le forme di trattamento chimico, compresa la fissazione della paraformaldeide e persino la colorazione dello iodio possono causare restringimento dei tessuti58,59. Mentre nessuno dei due metodi fornirà misurazioni delle "dimensioni effettive dell'organo" in una mosca vivente, le misurazioni morfometriche sono ancora valide quando si confrontano animali mutanti e wildtype purché le fasi di fissazione, colorazione e asciugatura siano eseguite in modo identico per entrambe le serie di campioni, preferibilmente in parallelo.
In conclusione, μ-CT fornisce un utile strumento di imaging di animali interi per Drosophila33,34,35,36,37,38,39,40,41. Molti altri studi hanno mostrato il potere di questa tecnologia per comprendere vari aspetti della tassonomia degli insetti, dell'ecologia, della fisiologia, dello sviluppo e dell'anatomia che possono aiutare a informare gli studi futuri sulle mosche1,28,30,31,32,55,56,57 . In combinazione con gli strumenti di microscopia genetica e leggera già ampiamente utilizzati in questo organismo, μ-CT può posizionarsi all'interno di una pipeline sperimentale che consente una comprensione più profonda tra genotipo e fenotipo.

I metodi di imaging che consentono l'indagine dettagliata delle strutture interne di un oggetto senza distruggere la sua architettura 3D complessiva si sono dimostrati ampiamente utili per una serie di discipline diverse, tra cui fisica, ingegneria, scienza dei materiali, archeologia, paleontologia, geologia e biologia1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Tra questi metodi di imaging non distruttivi, le piattaforme basate sui raggi X sono particolarmente utili grazie alla capacità dei raggi X ad alta energia di penetrare molti tipi di campioni e materiali diversi con una dispersione minima rispetto alle onde luminose visibili. La tomografia computerizzata (CT), la tomografia microcomputata (μ-CT), la tomografia nanocomputata (Nano-CT) e la microtomografia di sincrotrone sono quindi emerse come le tecnologie primarie per l'imaging a raggi X di campioni che vanno dai metri ai micron, con capacità di risoluzione da millimetro a sub-micron10,11, 12,13,14.
Mentre queste piattaforme differiscono nel loro design, geometria a raggi X e componenti al fine di bilanciare le dimensioni del campione e la risoluzione, si basano tutte sullo stesso principio di base per l'acquisizione delle immagini: una fonte di raggi X che viaggiano attraverso l'oggetto e vengono catturati da un rilevatore. L'attenuazione differenziale del fascio di raggi X mentre passa attraverso densità variabili all'interno dell'oggetto genera contrasto dell'immagine. I dati 3D si ottengono ruotando il campione o il rivelatore, raccogliendo una serie di immagini di proiezione 2D che vengono poi ricostruite utilizzando algoritmi in tomogrammi contenenti informazioni 3D la cui risoluzione è isotropa in x,y,z15. Per molti scanner μ-CT da banco che utilizzano una geometria a raggi X a fascio cono per proiettare raggi X sull'oggetto da visualizzare, l'algoritmo Feldkamp viene utilizzato per ricostruire con precisione l'oggetto con errori minimi16.
La risoluzione di una determinata piattaforma è determinata principalmente da parametri di sistema come la dimensione del fascio di raggi X (dimensione dello spot), la geometria dello scanner (distanza dall'oggetto alla sorgente di raggi X), la dimensione dei pixel sul rilevatore e l'algoritmo di ricostruzione utilizzato. Fattori aggiuntivi, come le vibrazioni dello scanner, le fluttuazioni del fascio di raggi X, il movimento del campione e il tipo di materiale o la macchia chimica utilizzata per visualizzare l'oggetto possono anche influenzare in modo significativo la risoluzione spaziale sotto le condizioni di imaging del mondo reale15.
Per le applicazioni biomediche, CT e μ-CT hanno svolto un ruolo chiave nel far progredire la nostra comprensione dell'anatomia, della fisiologia, dello sviluppo e dei meccanismi di malattia, fungendo da strumento sia per le diagnosi dei pazienti umani che come piattaforma di imaging preclinico per organismi modello17,18. Ad esempio, il Mouse International Phenotyping Consortium, il cui obiettivo è identificare la funzione di ogni gene nel genoma del topo, utilizza μ-CT come parte della loro pipeline di fenotipizzazione19. I loro risultati sono stati fondamentali per comprendere i geni coinvolti nello sviluppo e nei processi patologici, fungendo anche da atlante per l'anatomia e lo sviluppo del topo20. Altri organismi modello, come zebrafish e ratti, hanno anche abbracciato pienamente l'uso di μ-CT per eseguire la fenotipizzazione di animali interi di un numero di mutantigenetici 17,21,22,23.
Il vantaggio di combinare l'imaging di animali interi con organismi modello è che una comprensione meccanicistica della funzione genica per un dato processo biologico può essere completamente esplorata. Ciò è possibile grazie ai genomi ben caratterizzati e a molti strumenti genetici disponibili negli organismi modello che consentono una manipolazione precisa della funzione genica in distinti punti temporali dello sviluppo, tessuti specifici, singole cellule e persino organelli subcellulari. Questi includono sistemi di espressione binaria come il sistema UAS / GAL4 (e le sue molte derivate), CRISPR / Cas9 e RNAi24,25,26. Quando questi strumenti genetici vengono utilizzati in combinazione con una potente pipeline di imaging composta da microscopia elettronica, microscopia ottica (fluorescente e non fluorescente) e imaging di animali interi come μ-CT, è possibile ottenere una valutazione approfondita di molecole, cellule, tessuti, organi e l'intero organismo, consentendo una comprensione molto più profonda della funzione genica.
Questo protocollo si concentra sull'uso della μ-CT nell'organismo modello non mammifero Drosophila melanogaster, la cui miriade di strumenti genetici hanno contribuito a chiarire numerosi meccanismi molecolari26,27. È stato adottato da protocolli precedenti in insetti non modello1,28,29,30,31,32e si basa su precedenti studi μ-CT in Drosophila per stabilire un protocollo standardizzato per il suo uso in questo animale33,34,35,36,37,38,39 ,40,41. Vengono delineati i passaggi per la preparazione, l'imaging e l'analisi dei campioni di successo dei set di dati μ-CT delle mosche utilizzando scanner disponibili in commercio. Con questo protocollo, tutte le fasi di sviluppo della mosca possono essere visualizzate ad alta risoluzione per studi sia descrittivi che di test di ipotesi, tra cui tassonomia, anatomia, sviluppo, fisiologia e malattia27. Questo protocollo sarà anche utile per l'imaging praticamente di qualsiasi insetto e persino di materiali non viventi che richiedono la colorazione chimica per il contrasto dell'immagine per migliorare la visualizzazione mediante μ-CT.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For critical point drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#39;s Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT10132</td>
			<td>For animal fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dragonfly Software</td>
			<td>Object Research Systems</td>
			<td></td>
			<td>For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For microfuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine Solution (I2KI)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SI86-1</td>
			<td>For staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcomputed Tomography Scanner</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Skyscan 1172</td>
			<td>Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 &#181;m pixel size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcomputed Tomography Scanner Software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-15</td>
			<td>For poking hole in cuticle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRecon Image Reconstruction Software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipet tips</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-120</td>
			<td>Sample mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Resarch Products International</td>
			<td>P32060-4000.0</td>
			<td>Dilute to 1X with water before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic Acid Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79690-25g</td>
			<td>For staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26018-17</td>
			<td>For Minutien Pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>111036</td>
			<td>To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Ray Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Xradia 520 Versa</td>
			<td>Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD&#8482;)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole animal imaging of drosophila melanogaster using microcomputed tomography

Gli strumenti di imaging biomedico consentono di investigarsi dei meccanismi molecolari attraverso scale spaziali, dai geni agli organismi. Drosophila melanogaster, un organismo modello ben caratterizzato, ha beneficiato dell'uso della luce e della microscopia elettronica per comprendere la funzione genica a livello di cellule e tessuti. L'applicazione di piattaforme di imaging che consentano una comprensione della funzione genica a livello dell'intero organismo intatto migliorerebbe ulteriormente la nostra conoscenza dei meccanismi genetici. Qui viene presentato un metodo di imaging di animali interi che delinea i passaggi necessari per visualizzare Drosophila in qualsiasi fase dello sviluppo utilizzando la tomografia microcomputata (μ-CT). I vantaggi di μ-CT includono strumentazione disponibile in commercio e tempi pratici minimi per produrre informazioni 3D accurate a livello di micron senza la necessità di metodi di dissezione o compensazione dei tessuti. Abbinato a software che accelerano l'analisi delle immagini e il rendering 3D, è possibile eseguire un'analisi morfometrica dettagliata di qualsiasi tessuto o sistema di organi per comprendere meglio i meccanismi di sviluppo, fisiologia e anatomia per studi di test sia descrittivi che di ipotesi. Utilizzando un flusso di lavoro di imaging che incorpora l'uso di microscopia elettronica, microscopia ottica e μ-CT, è possibile eseguire una valutazione approfondita della funzione genica, promuovendo così l'utilità di questo potente organismo modello.

La Figura 2 mostra le immagini di un embrione, 3larve di instar, pupe allo stadio adulto di farato (P7) e una mosca femmina adulta macchiata di iodio e ettarata in acqua utilizzando uno scanner da banco commerciale. L'eccellente conservazione e persino la colorazione del tessuto delicato sono evidenti, consentendo a tutti i principali organi di essere facilmente identificati e utilizzati per l'analisi morfometrica e la visualizzazione 3D.
In genere, le scansioni che acquisiscono meno immagini di proiezione del campione forniscono una risoluzione inferiore rispetto alle scansioni che acquisiscono più immagini di proiezione, con il compromesso che è il tempo trascorso nella scansione. Sebbene i tempi di scansione varino in base allo strumento e ad altri parametri di scansione, le scansioni che acquisiscono alcune centinaia di proiezioni (~ 3 μm di dimensione pixel dell'immagine) richiedono circa 30 minuti per campione, mentre le scansioni costituite da migliaia di immagini di proiezione (700 nm-1,25 μm di dimensione pixel dell'immagine) possono richiedere 8-16 ore. Un confronto tra la stessa testa di mosca adulta presa in modalità di scansione sia "lenta" (migliaia di proiezioni) che "veloce" (centinaia di proiezioni) è mostrata nella Figura 3. È importante sottolineare che le analisi morfometriche non differiscono tra scansioni "lente" e "veloci"(Figura 3C)40. La nostra pipeline di imaging, quindi, utilizza scansioni veloci per generare una dimensione del campione sufficientemente grande per l'analisi morfometrica e scansioni lente per visualizzare eventuali difetti morfologici o anatomici a una risoluzione più elevata. Utilizzando il software (Step 7), qualsiasi tessuto o sistema di organi di interesse può essere segmentato e utilizzato per l'analisi morfometrica e visualizzato in 3D utilizzando il movie maker (Movie 1).
La Figura 4 mostra un esempio dell'addome della mosca macchiato con PTA e ripreso idratato (acqua) o dopo l'essiccazione del punto critico (CPD) su un microscopio a raggi X (Table of Materials). Il dettaglio offerto da una combinazione del PTA e delle capacità di questa piattaforma è facilmente evidente in queste immagini, in modo tale che le singole cellule epiteliali del midgut e i fasci di spermatozoi all'interno dei testicoli siano facilmente risolvibili. Mentre l'immagine CPD mostra una risoluzione leggermente aumentata rispetto al campione idratato, una migliore conservazione dell'ultrastruttura dei tessuti delicati (come le cellule adipose vicino alla cuticola) si ottiene con campioni idratati (Film 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica della progettazione dello scanner e del montaggio del campione per μ-CT. (A) Uno scanner μ CT da banco commerciale. (B) Vista all'interno dello scanner. La sorgente di raggi X (a destra) emette raggi X che passano attraverso il campione situato su uno stadio rotante (freccia gialla). L'attenuazione di questi raggi X genera il contrasto dell'immagine mentre passano attraverso il campione e sul rivelatore, che consiste in uno schermo a scintillazione che converte i raggi X in fotoni e una fotocamera CCD standard (a sinistra). (C) Montaggio di un moscerino della frutta adulto per immagini idratate in acqua. I punti di connessione tra la punta della pipetta e il supporto in ottone sono avvolti in un film di paraffina per evitare perdite e potenziali danni allo scanner. Anche il mandrino del palco è evidenziato. Si noti che la punta della pipetta è stata posizionata leggermente fuori asse, il che ha portato a un tempo di scansione più lungo e a una risoluzione ridotta nella ricostruzione finale. (D) Una singola immagine di proiezione 2D di una mosca femmina adulta; centinaia o migliaia di queste proiezioni vengono acquisite durante una scansione lungo l'asse di rotazione e vengono utilizzate per la ricostruzione per generare tomogrammi contenenti risoluzione isotropa e informazioni 3D accurate. Barre di scala (C) = 2 mm. P, posteriore; V, Ventrale. Questa cifra è stata modificata da Schoborg et al.40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig02.jpg"> Figura 2: Tutte le fasi del ciclo di vita di Drosophila melanogaster, immagini da μ-CT. Campioni colorati con iodio e ripresi idratati in acqua. Viene mostrata una singola sezione 2D. (A) Un embrione che ha completato le prime fasi della gastrulazione (asterisco). (B) Una terza larva instar. (C) Un adulto di farato P7 durante la metamorfosi. (D) Una femmina adulta. Vari organi sono evidenziati: BWM, muscoli della parete corporea; Br, cervello; Cd, cardia; Cr, raccolto; DLM, muscoli longitudinali dorsali; DVM, muscoli ventrali dorsali; E-AD, disco oculare-antennale; Em, embrione; FB, corpi grassi; FBC, cellule del corpo adiposo; H, cuore; Hg, intestino posteriore; La, lamina; L, gamba; Mg, midgut; OL, lobo ottico cerebrale; Ov, ovopositore; PC, cuticola pupale; SG, ghiandole salivari; VNC, cordone nervoso ventrale; W, ala; WD, disco alare. Barre di scala (A) = 100 μm; (B)-(D) = 500 μm. D, Dorsale; A, Anteriore; L, Sinistra. Parametri di scansione: Distanza da sorgente a campione (mm): (A, D) 36,5, (B) 48,8, (C) 40,3. Distanza dalla sorgente alla fotocamera (mm): (A, D) 350, (B, C) 285. Dimensione pixel della fotocamera (μm): (A-D) 11.6. Dimensione pixel immagine (μm): (A, D) 1.2, (B) 1.9, (C) 1.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig03.jpg"> Figura 3: I parametri di scansione e la risoluzione dell'immagine non alterano le analisi morfometriche. Una testa adulta scansionata utilizzando entrambe le impostazioni dello scanner(A, A'),"veloci" (centinaia di proiezioni) e(B, B')"lente" (migliaia di proiezioni). Il cervello è delineato in giallo. (C) Misurazioni del volume cerebrale da scansioni lente e veloci. Strutture in evidenza: AL; lobo antennale; CB, cervello centrale; FB, corpo a forma di ventaglio; FCs, cellule adipose; La, lamina; Lo, lobula; LoP, piastra di lobula; Io, midollo; Re, retina. n = 5, t-test di Welch. ns = non significativo. Barre di scala = 100 μm. Parametri di scansione: Distanza dalla sorgente al campione (mm): (A) 44.4, (B) 36.5. Distanza dalla sorgente alla fotocamera (mm): (A) 348 (B) 350. Dimensione pixel della fotocamera (μm): (A-B) 11.6. Dimensione pixel immagine (μm): (A) 2.95, (B) 1.2. Questa cifra è stata modificata da Schoborg et al.40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig04.jpg"> Figura 4: Addome di Drosophila melanogaster ripreso dalla microscopia a raggi X. Gli addominali sono stati colorati con lo 0,5% di PTA e ripresi idratati (acqua) o dopo l'essiccazione del punto critico (CPD). (A) Punto critico Addome essiccato, mostrato dalla prospettiva YZ e (A') XZ prospettiva. (B) Addome idratato, mostrato dalla prospettiva YZ e (B') prospettiva XZ. Vari organi sono evidenziati: FC, cellule adipose; Hg, intestino posteriore; Mg, Midgut; SP, Pompa dello sperma; Te, Testicoli. Barre di scala (A) = 250 μm. D, dorsale; A, Anteriore; L, Sinistra. Parametri di scansione: Distanza dalla sorgente al campione (mm): (A) 6.7, (B) 7. Distanza dalla sorgente alla fotocamera (mm): (A) 28 (B) 29.5. Obiettivo: (A-B) 4X. Dimensione pixel immagine (μm): (A-B) 0,65. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Film 1: Una terza larva instar, resa in 3D usando il Movie Maker in Dragonfly. Gli organi evidenziati includono il cervello (giallo), i dischi immaginali occhio-antennale (rosso), il corpo grasso (blu) e i muscoli della parete corporea (verde). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61515/Movie_1_Revised.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo film.</a>
Filmato 2: Confronto di campioni ripresi in acqua o dopo l'essiccazione del punto critico. Vengono mostrati addominali macchiati con 0,5% di PTA. Entrambi gli addominali sono stati scansionati con impostazioni identiche delle dimensioni dei pixel dell'immagine (0,65 μm). Una serie di fette 2D sono mostrate in un formato "Z-stack" (YZ) che inizia dalla superficie dorsale e termina sulla superficie ventrale dell'addome. Organi evidenziati: FC, cellule adipose; Mg, Midgut; SP, Pompa dello sperma; Te, Testicoli. Parametri di scansione: Distanza dalla sorgente al campione (mm): (A) 6.7, (B) 7. Distanza dalla sorgente alla fotocamera (mm): (A) 28 (B) 29.5. Obiettivo: (A-B) 4X. Dimensione pixel immagine (μm): (A-B) 0,65. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61515/Movie_2_Revised.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo film.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography at JoVE.com

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Viene presentato un protocollo che consente la visualizzazione di Drosophila melanogaster intatto in qualsiasi fase dello sviluppo utilizzando la tomografia microincisa.

Imaging di animali interi di Drosophila melanogaster utilizzando la tomografia microincisa

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

whole-animal-imaging-drosophila-melanogaster-using-microcomputed

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

4.8K Views.  University of Wyoming. Viene presentato un protocollo che consente la visualizzazione di Drosophila melanogaster intatto in qualsiasi fase dello sviluppo utilizzando la tomografia microincisa.

Video: Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Imaging Upright di<em&gt; Drosophila</em&gt; Chambers Egg

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Saggio popolazioni cellulari del sangue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Allevamento la mosca della frutta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sotto axeniche e Gnotobiotic Condizioni

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. This morphological alteration is also recognized as epithelial to mesenchymal transition (EMT). Dysregulation of EMT is associated with fibrosis and cancer metastasis. There is emerging evidence that EMT is controlled by a number of molecular mechanisms. As such, many key genes that control apical constriction are also known to be important factors in the EMT observed in cancer metastasis. Like EMT during Drosophila gastrulation, epithelial cells can be induced to change their shape and be reprogrammed to redirect cell fate towards various other cell types. Here we provide a robust imaging method of Drosophila gastrulation to assay the initiation of morphogenetic cellular movements and cell fate identification during this stage of embryonic development. Using this method, we identify cell rearrangement at the time of gastrulation and demonstrate the importance of apical constriction during gastrulation using GFP labeled DE-cadherin.

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Herein we describe a procedure to capture live images of Drosophila gastrulation. This has enabled us to better understand the apical constriction involved in early development and further analyze mechanisms governing cellular movements during tissue structure modification.

Imaging di cellule di figura alterazione e la cella in Movimento<em&gt; Drosophila</em&gt; gastrulation Utilizzando DE-caderina Reporter mosche transgeniche

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Scongelamento, coltura e Cryopreserving linee di cellule di Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

Metodi per testare la disgregazione endocrina nella Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Analisi per l'integrità della barriera del cervello edelico nella Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ribonucleoprotein particle movement, mRNA localization, organelle movement, and cytoskeletal dynamics. There are several methods for live imaging that have been developed. Due to the fact that each method involves dissecting individual ovarioles placed in media or halocarbon oil, cellular damage due to hypoxia and/or physical manipulation will inevitably occur over time. One downstream effect of hypoxia is to increase oxidative damage in the cells. The purpose of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries after induction of controlled cellular damage. Here, we use hydrogen peroxide to induce cellular oxidative damage and give examples of the effects of such damage on two subcellular structures, mitochondria and Clu bliss particles. However, this method is applicable to any subcellular structure. The limitations are that hydrogen peroxide can only be added to aqueous media and would not work for imaging that uses halocarbon oil. The advantages are that hydrogen peroxide is readily available and inexpensive, acts quickly, its concentrations can be modulated, and oxidative damage is a good approximation of damage caused by hypoxia as well as general tissue damage due to manipulation.

The objective of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries.

Visualizzazione degli effetti dei danni ossidativi sulle camere delle uova Drosophila utilizzando l&apos;imaging dal vivo

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged molecules within complex biological samples. While traditional confocal microscopes allow one to resolve two adjacent fluorescent point sources located a few hundred nanometers apart, observing the finer details of subcellular biology requires the ability to resolve signals in the order of tens of nanometers. Numerous hardware-based methods for super-resolution microscopy have been developed to allow researchers to sidestep such resolution limits, although these methods require specialized microscopes that are not available to all researchers. An alternative method for increasing resolving power is to isotropically enlarge the sample itself through a process known as expansion microscopy (ExM), which was first described by the Boyden group in 2015. ExM is not a type of microscopy per se but is rather a method for swelling a sample while preserving the relative spatial organization of its constituent molecules. The expanded sample can then be observed at an effectively increased resolution using a traditional confocal microscope. Here, we describe a protocol for implementing ExM in whole-mount Drosophila embryos, which is used to examine the localization of Par-3, myosin II, and mitochondria within the surface epithelial cells. This protocol yields an approximately four-fold increase in sample size, allowing for the detection of subcellular details that are not visible with conventional confocal microscopy. As proof of principle, an anti-GFP antibody is used to distinguish distinct pools of myosin-GFP between adjacent cell cortices, and fluorescently labeled streptavidin is used to detect endogenous biotinylated molecules to reveal the fine details of the mitochondrial network architecture. This protocol utilizes common antibodies and reagents for fluorescence labeling, and it should be compatible with many existing immunofluorescence protocols.

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Here, a protocol for the implementation of expansion microscopy in early Drosophila embryos to achieve super-resolution imaging using a conventional laser-scanning confocal microscope is presented.

Utilizzo della microscopia ad espansione per ingrandire fisicamente embrioni di Drosophila a montaggio intero per l'imaging a super-risoluzione

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...

Imaging di espianti cerebrali vivi da larve di Drosophila melanogaster terzo stadio

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Autore in primo piano: Indagine sulle dinamiche di divisione cellulare asimmetrica: un protocollo per l'imaging dal vivo di espianti di cervello larvale di Drosophila 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Imaging delle cellule vive di Drosophila melanogaster Terzo stadio Larvale Cervelli

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...