في هذا الجسيمات، ونحن نقدم منصة إعادة تشكيل في المختبر الذي يحاكي البيئة الدهنية من الغشاء الداخلي الميتوكوندريا. يمكن استخدام هذه المنصة للتحقيق في الآليات الجزيئية للغشاء الميتوكوندريا الداخلي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتحري الكمي عن بروتينات الأغشية المتكاملة والبروتينات المرتبطة بالأغشية في بيئة محلية قريبة.
للبدء، مزيج الحلول A و B وفقا لاتجاهات المخطوطات، ثم توليد خليط الدهون عن طريق إضافة حجم محسوب من محلول التخزين في قارورة العنبر مع حقنة زجاجية. طابق حجم النهائي بإضافة الكلوروفورم إضافية في قوارير. خبز المجهر الشرائح الزجاجية في 520 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
بعد الخبز، تبريدها إلى درجة حرارة الغرفة. إضافة ما يقرب من 10 غراما من هيدروكسيد الصوديوم إلى 500 ملليلتر من الميثانول مع اثارة. اثارة لمدة ساعتين، والاستمرار في إضافة هيدروكسيد الصوديوم إلى المحلل حتى يعجل تبدأ في إظهار.
تنظيف الشرائح الزجاجية في 10٪ الصوديوم دوديسيل حل كبريتات، الميثانول المشبعة هيدروكسيد الصوديوم، و 50 ملليمولر حمض الهيدروكلوريك، حمام بالتسلسل sonicating الشرائح تحت كل شرط لمدة 30 دقيقة. تنظيف الشرائح الزجاجية في الماء فائقة الخطورة لمدة 10 دقائق بين كل حالة. تخزين غطاء نظيفة مختومة في محلول حمض الهيدروكلوريك لمدة تصل إلى أسبوعين لضمان نوعية جيدة ثنائية الطبقة.
تنظيف الحوض الصغير متعدد الفلولورو من نظام غمس Langmuir-Blodgett باستخدام الكلوروفورم والمياه فائقة السخاء حتى يتم ملاحظة أي التبول. رش الكلوروفورم على سطح الحوض الصغير وامسحه تمامًا ثلاث مرات باستخدام مناديل السليلوز ، ثم شطفه ثلاث مرات بالماء فائق السخاء وإزالة الماء عن طريق الشفط. عند الانتهاء، تغطية سطح الحوض الصغير مع المياه فائقة الpure نظيفة.
اتخاذ قطعتين من الغطاء السطحي المعالجة من محلول التنظيف وشطف لهم بالماء فائقة الpure لمدة 30 ثانية تقريبا. ضع غطاء الزجاج بطريقة من الخلف إلى الخلف باستخدام المشبك الركيزة لعقد الشرائح الزجاجية. غمر الشريحة الزجاجية تحت سطح الماء بالنقر يدويًا على نظام التحكم في Langmuir.
صفر توازن الفيلم وانتشرت بعناية الحل B قطرة قطرة في واجهة المياه الهواء. تأكد من أن الدهون تنتشر فقط في واجهة الماء الهواء مع عدم وجود قطرات الكلوروفورم والدهون تغرق إلى الجزء السفلي من سطح البوليتيترافلورو الإيثيلين، والتي سوف تخلق قناة الدهون ومنع تشكيل أحادية الطبقة. التوقف عن إضافة الدهون عندما يكون الفيلم قراءة التوازن حوالي 15 إلى 20 millinewton لكل متر.
انتظر لمدة 10 إلى 15 دقيقة، ثم قم ببدء وحدة تحكم الحاجز لتغيير مساحة السطح بالنقر فوق تجربة البدء. الانتظار حتى يزيد رصيد الفيلم قراءات إلى 37 millinewton لكل متر والحفاظ على الضغط لمدة 20 إلى 30 دقيقة تقريبا. رفع الغطاء في سرعة 22 ملليمتر في الدقيقة مع الحفاظ على التوتر السطحي في 37 ميلينوتون لكل متر.
وسيتم نقل monolayer الدهون مع ربط البوليمر من واجهة المياه الهواء إلى سطح الغطاء من خلال عملية غمس Blodgett، وتشكيل نشرة أسفل من طبقة ثنائية الدهون. تنظيف واجهة المياه الهوائية عن طريق شفط وشطف الحوض الصغير مع الماء فائقة الpure. بعد تنظيف شريحة زجاجية ذات رفاهية واحدة مع الكلوروفورم والإيثانول والماء فائق السخاء ، قم بتعيينه على الحوض الصغير تحت طبقة الماء.
تأكد من أن البئر يواجه واجهة الماء الهوائي وصب الماء النقي فائق البور حتى يتم تغطية الشريحة الزجاجية بالكامل، ثم غمر الشريحة الزجاجية تحت سطح الماء كما سبق وصفه. عقد غطاء مع monolayer الدهون باستخدام كوب شفط السيليكون ودفع بلطف monolayer الدهون إلى واجهة المياه الهواء. اضغط على زجاج الغطاء لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوانٍ في الواجهة، ثم ادفعه مقابل الشريحة.
أخرج الشريحة مع الغطاء. خذ الغطاء وطبقة ثنائية إلى مجهر epifluorescence وصورة الدهون طبقة ثنائية وفقا لاتجاهات مخطوطة النص. إعداد طبق تبلور يحتوي على الماء فائقة السخ ووضع حلقة صورة المجهر نظيفة تحت الطبق.
غمر هذه الشريحة وغطاء الزجاج التي تحتوي على الدهون طبقة ثنائية تحت الماء. فصل بلطف الشريحة وغطاء زجاج، وعقد الشريحة غلاف من أسفل ونقل الغطاء إلى حلقة الصورة. استبدل الماء فائق الخطورة في حلقة الصورة بمخزن كلوريد الصوديوم ثنائي الصوديوم، مع التأكد من عدم تعرض الطبقة الثنائية الدهنية لأي فقاعات هوائية.
إضافة 1.1 نانوموللار ن-أوتيل-بيتا-غلوكوبيرانوسيسايد إلى طبقة الدهون الثنائية، ثم تضاف على الفور خليط من 1.2 نانومولار DDM و 1.3 picomoles من تنقية L-OPA1 في حلقة الصورة. احتضان العينة على شاكر مقاعد البدلاء في سرعة منخفضة لمدة ساعتين. توزيع 30 ملليغرام SM-2 الخرز الراتنج في ثلاثة ملليلتر من العازلة bis-tris وتهتز.
استخدام ماصة بلاستيكية لإضافة 5 إلى 10 ميكرولترات من الخرز الراتنج SM-2 إلى حلقة الصورة واحتضان لمدة 10 دقائق، ثم شطف الخرز الراتنج. يجب أن يكون حجم المخزن المؤقت النهائي في حلقة الصورة 1.5 ملليلتر. إعداد مليغرام واحد من خليط الدهون A في محلول الكلوروفورم، ثم تتبخر الكلوروفورم تحت تدفق النيتروجين لمدة 20 دقيقة.
الحفاظ على الخليط تحت فراغ بين عشية وضحاها لتشكيل فيلم الدهون. إعداد 50 ملليمولر الكالسيوم التي تحتوي على العازلة عن طريق حل 15.56 غرام من الكالسين في 50 ملليلتر من 1.5 مولار محلول هيدروكسيد الصوديوم. يُحرّك الخليط في درجة حرارة الغرفة حتى يذوب الكالسين تمامًا.
إضافة 12.5 ملليمولار مكرر تريس والمياه فائقة الpure لحجم النهائي من 500 ملليلتر وضبط درجة الHH إلى 7.5. الاستغناء عن فيلم الدهون في كالسين التي تحتوي على العازلة، ثم هيدرات الدهون تماما عن طريق تسخين التعليق في 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. شكل 200 نانومتر ليبوسومات عن طريق البثق مع غشاء البولي.
إضافة اثنين من ميكروغرام من L-OPA1 في 0.5 ميكرومولار DDM, 2.2 ملليغرام ليبسومس واحتضان الحل في أربع درجات مئوية لمدة 1.5 ساعة. إزالة السطحي عن طريق غسيل الكلى مع كاسيت غسيل الكلى 3.5 كيلودالون ضد 250 ملليلتر من 25 ملليمولار مكرر تريس، 150 ملليمولار كلوريد الصوديوم، و 50 ميليمولار العازلة الكالسيوم في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها، وتغيير العازلة مرتين. قم بإزالة الكالسين الإضافي باستخدام عمود إزالة التشبع PD10، ثم تابع التصوير وتحليل البيانات كما هو موضح في مخطوطة النص.
تظهر هنا صور المجهر Epifluorescence من طبقة الدهون ثنائية الدهون وسيلته الدهون. يتم عرض توزيع الدهون قبل وبعد تبييض الصورة ويظهر التجانس قبل وبعد إعادة تشكيل. L-OPA1 المعاد تشكيلها والدهون ثنائي طبقة تم التحقق من صحة من قبل التحليل الطيفي ارتباط الفلوريسنس أو FCS.
وأشار منحنيات FCS أن 75٪ من L-OPA1 أعيد تشكيلها في طبقة ثنائية الدهون مما يشير إلى أن L-OPA1 ينشر بحرية في البوليمر ربط الدهون ثنائية طبقة مع إمكانية تجميع الذاتي في مجمعات وظيفية. أشار تبييض خطوة الفلوريسنس إلى أن ما متوسطه نسختين إلى ثلاث نسخ من L-OPA1 أعيد تشكيلها في ليبوسوم معين. تم اختبار توزيع حجم L-OPA1 proteoliposomes المعاد تشكيلها بعد إعادة تشكيل باستخدام DLS والتحقق من FCS.
تم رصد الربط الغشاء من خلال مراقبة إشارة تكساس الأحمر على سطح طبقة ثنائية الدهون باستخدام المجهر TIRF. تم رصد غشاء الدهون دي خلط أو hemifusion من خلال تكساس الأحمر كما علامة liposome تنتشر في طبقة الدهون ثنائية. ساعد Calcein de-إخماد على تمييز تكوين المسام الاندماج الكامل من خلط الدهون فقط ، مما يسمح بالمقارنة بين الظروف التي تماطل فيها الجسيمات عند الخفقان والجسيمات التي تنتقل إلى الانصهار الكامل.
وقد أشار الربط الغشاء من قبل إشارة الدهون مستقرة من liposomes وإشارة الانصباب ظهرت أي إزالة الإخماد في إشارة calcein، ولكن الاضمحلال السريع للإشارة الحمراء تكساس أشار إلى انتشار الصبغة في طبقة الدهون ثنائية. الانصهار الكامل ظهرت كل من اضمحلال الدهون والمحتوى الإفراج. عند محاولة هذا الجسيم، تذكر لتنظيف شامل كل من الغطاء وجلد Langmuir لضمان يتم تصنيعها ثنائية الطبقات من جودة عالية.
نوعية الهواء الجيدة هو أيضا أمر بالغ الأهمية لمنع العيوب في طبقة ثنائية. هذه التقنية تمهد الطريق لنا لاستكشاف أسئلة جديدة في ديناميات غشاء الميتوكوندريا والتنظيم. وتشمل التجربة المستقبلية المثيرة استكشاف تأثير قياس الغشاء الثنائي الطبقة، وإمكانية الأغشية، والمسوخ المرتبطة بالأمراض في ديناميات الغشاء الداخلي للميتوكوندريا.
