Bu parçacıkta, mitokondri iç zarının lipid ortamını taklit eden bir in vitro reconstitution platformu sokulmaktadır. Bu platform mitokondri iç membran füzyonunun moleküler mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, yakın bir yerli ortamda integral membran proteinleri ve membran ilişkili proteinlerin kantitatif araştırılmasına olanak sağlamasıdır.
Başlamak için, el yazması yönlere göre A ve B çözeltilerini karıştırın, daha sonra hesaplanan depolama çözeltisi hacmini bir cam şırınga ile kehribar şişelerine ekleyerek lipid karışımını oluşturun. Şişelere ekstra kloroform ekleyerek son hacmi eşleştirin. 30 dakika boyunca 520 santigrat derece mikroskop coverglass slaytlar pişirin.
Piştikten sonra oda sıcaklığında soğutun. Karıştırırken 500 mililitre metanol e yaklaşık 10 gram sodyum hidroksit ekleyin. İki saat karıştırın, çökelti göstermeye başlayana kadar çözeltiye sodyum hidroksit eklemeye devam edin.
Cam slaytları %10 sodyum dodecyl sülfat çözeltisi, sodyum hidroksit ile doymuş metanol ve 50 milimolar hidroklorik asitle temizleyin, her koşulda slaytları 30 dakika boyunca sırayla banyolayın. Cam slaytları her koşul arasında 10 dakika boyunca ultra saf suda temizleyin. Temizlenmiş kapak camı, iyi iki katmanlı kalite sağlamak için iki haftaya kadar hidroklorik asit çözeltisinde saklayın.
Langmuir-Blodgett daldırma sisteminin politetrafloroetilen yalakını kloroform ve ultra saf su kullanarak ıslatma gözlemlenene kadar temizleyin. Kloroform püskürtün yalak yüzeyinde ve selüloz mendil ile iyice üç kez silin, sonra ultrasaf su ile üç kez durulayın ve emme yoluyla su kaldırın. Bittiğinde, temiz ultra saf su ile yalak yüzeyini kaplayın.
Temizleme çözeltisinden iki parça yüzeyişlenmiş kapak camı alın ve ultra saf suyla yaklaşık 30 saniye durulayın. Cam slaytları tutmak için alt tabaka kelepçesini kullanarak coverglass'ı arka arkaya yerleştirin. Langmuir kontrol sistemine elle tıklayarak cam kaydırağı su yüzeyinin altına daldırın.
Sıfır film dengesi ve dikkatle yayıldı çözüm B damla hava su arayüzü nde damla. Lipitlerin sadece kloroform ve lipit damlacıkları ile hava su arabiriminde yayıldıktan emin olun, bu da bir lipid kanalı oluşturacak ve monolayer oluşumunu önleyecek politetrafloroetilen yüzeyinin dibine batan. Film dengesi okuma metre başına 15-20 milimetre civarında olduğunda lipid eklemeyi bırakın.
10 ila 15 dakika bekleyin, ardından başlat deneyi tıklayarak yüzey alanını değiştirmek için bariyer denetleyicisini başlatın. Film dengesi okuma metre başına 37 milinewton artar kadar bekleyin ve yaklaşık 20-30 dakika basınç tutmak. Yüzey gerilimini metre de 37 milimetre hızında tutarken kapak camı dakikada 22 milimetre hızla kaldırın.
Polimer tethering ile bir lipid monolayer blodgett daldırma işlemi ile coverglass yüzeyine hava su arayüzü transfer edilecektir, lipid iki katmanlı alt broşür oluşturan. Hava suyu arayüzünü emme ile temizleyin ve yalak ultra saf su ile durulayın. Kloroform, etanol ve ultra saf su ile tek kuyulu cam slayt temizledikten sonra, su tabakasının altındaki yalak üzerine ayarlayın.
Kuyunun hava suyu arayüzüne dönük olduğundan emin olun ve cam kaydırak tamamen kaplanana kadar taze ultrasaf su dökün, ardından cam kaydırağı daha önce açıklandığı gibi su yüzeyinin altına batırın. Bir silikon emme kabı kullanarak lipid monolayer ile coverglass tutun ve yavaşça hava su arayüzü lipid monolayer itin. Kapak camı arabirimde 2-3 saniye tutun ve kaydırak üzerinde itin.
Kapağı nı camla kaydıra. Coverglass ve iki katmanlı bir epifloresan mikroskobu alın ve metin el yazması yönergelerine göre lipid iki katmanlı görüntü. Ultra saf su içeren bir kristalizasyon çanak hazırlayın ve çanak altında temiz bir mikroskop görüntü halkası yerleştirin.
Suyun altında lipid iki katmanlı içeren bu slayt ve coverglass batırın. Kapak camını alttan tutarak slaytı ve coverglass'ı yavaşça ayırın ve kapak camı görüntü halkasına aktarın. Görüntü halkasındaki ultrasaf suyu bis-tris sodyum klorür tamponu ile değiştirin, böylece lipid iki katmanlı herhangi bir hava kabarcığına maruz kalmamasını sağlar.
Lipid bi-tabaka için 1.1 nanomolar n-octyl-beta-glucopyranoside ekleyin, sonra hemen 1.2 nanomolar DDM ve saflaştırılmış L-OPA1 1.3 picomoles karışımını ekleyin görüntü halkası içine. İki saat boyunca düşük hızda bir tezgah üstü shaker üzerinde örnek kuluçka. 30 miligram SM-2 rekarne boncukları üç mililitre bis-tris tamponuna dağıtın ve tlayın.
Görüntü halkasına 5 ila 10 mikrolitre SM-2 reşin boncukları eklemek ve 10 dakika kuluçkaya yatırmak için plastik bir pipet kullanın, ardından resenin boncuklarını durulayın. Görüntü halkasındaki arabelleğe son hacim 1,5 mililitre olmalıdır. Bir miligram lipid karışımı hazırlayın Kloroform çözeltisi içinde A, sonra 20 dakika boyunca azot akışı altında kloroform buharlaştırmak.
Bir lipid film oluşturmak için vakum altında bir gecede karışımı tutun. 1,5 molar sodyum hidroksit çözeltisi 50 mililitre calcein 15,56 gram eriterek tampon içeren 50 milimoler kalsiyum hazırlayın. Calcein tamamen eriyene kadar oda sıcaklığında karışımı karıştırın.
500 mililitrelik son hacim için 12,5 milimolar bis-tris ve ultra saf su ekleyin ve pH'ı 7,5'e ayarlayın. Tampon içeren kalsin lipid film dağıtmak, sonra tam 20 dakika boyunca 65 santigrat derece süspansiyon ısıtarak lipid nemlendirmek. Bir polikarbonat membran ile ekstrüzyon yoluyla Form 200 nanometre lipozomlar.
0,5 mikropozlar DDM' ye iki mikrogram L-OPA1, 2,2 miligram lipozom ekleyin ve çözeltiyi 1,5 saat boyunca dört santigrat derecede inkübün. 25 milimolar bis-tris, 150 milimolar sodyum klorür ve 50 milimolar kalsiyum tampon bir gecede dört derece santigrat derecede karşı 3,5 kilodalton diyaliz kaseti ile diyaliz ile yüzey aktif madde yi çıkarın, tampon iki kez değiştirerek. PD10 tuzsuzlama sütunu kullanarak ekstra kalsin kaldırın, ardından metin makalesinde açıklandığı gibi görüntüleme ve veri analizine devam edin.
Bir lipid iki katmanlı epifloresan mikroskopi görüntüleri ve lipid akışkanlığı burada gösterilmiştir. Lipid dağılımı fotoğraf beyazlatma öncesi ve sonrası gösterilir ve homojenlik yeniden yapılanma öncesi ve sonrası gösterilir. L-OPA1 yeniden oluşturuldu ve lipid iki katmanlı floresan korelasyon spektroskopisi veya FCS ile doğrulandı.
FCS eğrileri, L-OPA1'in %75'inin lipid bi tabakasına yeniden oluşturulduktan sonra l-OPA1'in polimer tethered lipid bi-tabakasında serbestçe yayıldığını ve fonksiyonel komplekslere kendi kendini birleştirme potansiyeline sahip olduğunu göstermiştir. Floresan adım ağartma, l-OPA1'in ortalama iki ila üç kopyasının belirli bir lipozomda yeniden oluşturulduğuni göstermiştir. L-OPA1 reconstituted proteoliposomes boyut dağılımı DLS kullanılarak yeniden yapıldıktan sonra test edildi ve FCS ile doğrulandı.
Membran tethering TIRF mikroskopi kullanılarak lipid iki katmanlı yüzeyinde Texas Red sinyali gözlemleyerek izlendi. Membran lipid de-mikser veya hemifüzyon lipid bi-tabaka içine yayılmış lipozom marker olarak Texas Red ile izlendi. Calcein de-quenching sadece lipid de-mixing tam füzyon gözenek oluşumu ayırt yardımcı, parçacıkların hemifüzyon ve tam füzyon devam parçacıklar durak koşullar arasında karşılaştırma sağlayan.
Membran tethering lipozomlar ve efüzyon sinyali istikrarlı bir lipid sinyali ile endike calcein sinyali hiçbir de-quenching özellikli, ancak Texas Kırmızı sinyalhızlı bir çürüme lipid bi katmanlı içine boya difüzyon gösterdi. Tam füzyon hem lipid çürümesi ve içerik sürümü özellikli. Bu parçacığı denerken, yüksek kalitede iki katmanlı imal olduğundan emin olmak için hem coverglass'ı hem de Langmuir yalaklarını iyice temizlemeyi unutmayın.
İyi hava kalitesi de iki katmanlı kusurları önlemek için önemlidir. Bu teknik, mitokondri membran dinamiği ve organizasyonunda yeni sorular keşfetmenin önünü açarak. Heyecan verici gelecekteki deney mitokondri iç membran dinamikleri iki katmanlı assymetri, membran potansiyeli ve hastalık ile ilgili mutantların etkisini keşfetmek içerir.
