이 입자에서는 미토콘드리아 내막의 지질 환경을 모방한 체외 재구성 플랫폼을 소개합니다. 이 플랫폼은 미토콘드리아 내막 융합의 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 거의 네이티브 환경에서 일체형 막 단백질과 막 관련 단백질의 정량적 조사를 허용한다는 것입니다.
시작하려면 원고 방향에 따라 솔루션 A와 B를 혼합한 다음, 유리 주사기로 호박색 바이알에 저장 용액의 계산된 볼륨을 추가하여 지질 혼합물을 생성합니다. 바이알에 클로로폼을 추가하여 최종 볼륨을 일치시합니다. 현미경 커버글래스 슬라이드를 섭씨 520도에서 30분간 굽습니다.
베이킹 후 실온으로 식힙니다. 교반하는 동안 수산화 나트륨 약 10 그램을 메탄올 500 밀리리터에 추가합니다. 2시간 동안 저어서 침전이 나타날 때까지 수산화나트륨을 용액에 계속 추가합니다.
유리 슬라이드를 10% 나트륨 도데실 황산염 용액, 수산화나트륨으로 포화된 메탄올, 50밀리머 염산으로 청소하여 각 조건하에서 슬라이드를 30분 동안 순차적으로 초음파 처리합니다. 유리 슬라이드를 초순수 물로 청소하여 각 조건 사이에 10분 간 청소합니다. 깨끗한 커버글래스를 염산 용액에 밀봉하여 최대 2주 동안 보관하여 양층 품질을 보장합니다.
젖지 않을 때까지 클로로폼과 초순수를 사용하여 랑뮤어-블로젯 디핑 시스템의 폴리테트라플루오로틸렌 트로프를 청소하십시오. 클로로폼을 쓰루 표면에 뿌리고 셀룰로오스 물티슈로 세 번 철저히 닦은 다음 초순수물로 3번 헹구고 흡입을 통해 물을 제거합니다. 완료되면, 깨끗한 초순수물로 쓰루의 표면을 덮습니다.
세정 용액에서 표면 처리 된 커버 글래스 두 조각을 가져 와서 약 30 초 동안 초순수물로 헹구십시오. 커버글래스를 기판 클램프를 사용하여 유리 슬라이드를 고정하는 방식으로 앞뒤로 놓습니다. Langmuir 제어 시스템에서 디퍼를 수동으로 클릭하여 수면 아래유리 슬라이드를 담급하십시오.
필름 밸런스를 제로하고 조심스럽게 확산 솔루션 B 는 공기 물 인터페이스에서 드롭하여 드롭. 지질채널이 형성되고 단층 형성을 방지하는 폴리테트라플루오로틸렌 표면의 바닥으로 가라앉는 클로로폼과 지질 방울이 없는 공기물 인터페이스에서만 지질이 확산되고 있는지 확인하십시오. 필름 밸런스 판독이 미터당 약 15~20밀리리터일 때 지질 추가를 중단하십시오.
10~15분 기다린 다음 배리어 컨트롤러를 시작하여 시작 실험을 클릭하여 표면적을 변경합니다. 필름 밸런스 판독이 미터당 37밀리뉴턴으로 증가할 때까지 기다렸다가 약 20~30분 동안 압력을 유지합니다. 미터당 37밀리톤의 표면 장력을 유지하면서 분당 22밀리미터의 속도로 커버글래스를 올립니다.
폴리머 테더링을 하는 지질 단층은 공기물 인터페이스에서 블로젯 디핑 공정을 통해 커버글래스 표면으로 옮겨지질 이중층의 하단 리플렛을 형성한다. 흡입에 의해 공기 물 인터페이스를 청소하고 초순수물로 트로프를 헹구는 다. 클로로폼, 에탄올 및 초순수로 한 웰드 글라스 슬라이드를 청소한 후 물 층 아래 의 트로프에 놓습니다.
우물이 공기 물 인터페이스를 향해 향하고 있는지 확인하고 유리 슬라이드가 완전히 덮여 때까지 신선한 초순수물을 부어, 다음 이전에 설명한 대로 수면 아래에 유리 슬라이드를 담급. 실리콘 흡입 컵을 사용하여 지질 모노 레이어로 커버 글래스를 잡고 지질 단층을 공기 물 인터페이스로 부드럽게 밀어 넣습니다. 인터페이스에서 2~3초 동안 커버 글래스를 누은 다음 슬라이드에 밀어 넣습니다.
커버글래스로 슬라이드를 꺼내십시오. 표지유리와 이중층을 상피 현미경으로 가져 가서 텍스트 원고 지침에 따라 지질 이중 층을 이미지화하십시오. 초순수가 함유된 결정화 접시를 준비하고 깨끗한 현미경 이미지 링을 접시 아래에 놓습니다.
물 밑에 지질 이중 층이 들어있는이 슬라이드와 커버 글래스를 담급하십시오. 슬라이드와 커버글래스를 부드럽게 분리하고 커버글래스 슬라이드를 바닥에서 잡고 커버글래스를 이미지 링으로 옮습니다. 이미지 링의 초순수수를 비스트리스 염화나트륨 버퍼로 교체하여 지질 이중층이 기포에 노출되지 않도록 합니다.
지질 이중층에 1.1 나노몰라 n-옥틸 베타 글루카피라노사이드를 추가한 다음 즉시 1.2 나노몰러 DDM과 1.3개의 정제된 L-OPA1의 혼합물을 이미지 링에 추가합니다. 샘플을 벤치 탑 셰이커에 2시간 동안 저속으로 배양합니다. 30 밀리그램 SM-2 수지 구슬을 비스 트리스 버퍼 및 쉐이크의 3밀리리터에 분배합니다.
플라스틱 파이펫을 사용하여 SM-2 수지 구슬의 5~10마이크로리터를 이미지 링에 추가하고 10분 동안 배양한 다음 수지 구슬을 헹구습니다. 이미지 링의 버퍼의 마지막 볼륨은 1.5 밀리리터여야 합니다. 엽록소용액으로 지질 혼합물 A 1밀리그램을 준비한 다음 질소 흐름 하에서 클로로폼을 20분 동안 증발시다.
지질 필름을 형성하기 위해 밤새 진공 상태에서 혼합물을 유지합니다. 1.5 개의 어금니 나트륨 수산화 용액의 50 밀리리터에서 15.56 그램의 칼신을 용해하여 완충액을 함유 한 50 밀리마일칼슘을 준비하십시오. 칼신이 완전히 녹을 때까지 실온에서 혼합물을 저어줍니다.
12.5 밀리몰러 비스 트리스와 초순수수를 추가하여 500밀리리터의 최종 부피를 추가하고 pH를 7.5로 조정합니다. 완충액을 함유한 칼신에 지질 필름을 분배한 다음, 20분 동안 섭씨 65도에서 서스펜션을 가열하여 지질을 완전히 수화합니다. 폴리카보네이트 멤브레인을 통해 압출을 통해 200 나노미터 리포솜을 형성합니다.
0.5 마이크로몰라 DDM에 L-OPA1 2마이크로그램을 추가하고, 2.2 밀리그램 리포솜을 넣고 1.5시간 동안 섭씨 4도에서 용액을 배양합니다. 3.5킬로달톤 투석 카세트로 투석하여 계면활성제를 제거하여 25밀리리터 250밀리리터, 150밀리머 나트륨 염화나트륨, 50밀리알라 칼슘 완충제를 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 제거하여 완충제를 두 번 변경합니다. PD10 탈염 열을 사용하여 여분의 calcein을 제거한 다음 텍스트 원고에 설명된 대로 이미징 및 데이터 분석을 진행합니다.
지질 이중층과 지질 유동성의 상피 현미경 현미경 이미지는 여기에 표시됩니다. 지질 분포는 사진 표백 전후에 표시되며, 균질성은 재구성 전후에 나타난다. L-OPA1 재구성 및 지질 이중층은 형광 상관 분광법 또는 FCS에 의해 검증되었다.
FCS 곡선은 L-OPA1의 75%가 지질 이중층으로 재구성되어 L-OPA1이 중합체 테더지질 이중층에서 자유롭게 확산되어 기능성 복합체로 자가 조립할 수 있음을 시사했습니다. 형광 단계 표백은 L-OPA1의 평균 2 ~ 3 사본이 주어진 리포솜에서 재구성되었다는 것을 표시했습니다. L-OPA1 재구성 프로테오이포좀의 크기 분포는 DLS를 사용하여 재구성한 후 테스트되었으며 FCS로 검증되었습니다.
멤브레인 테더링은 TIRF 현미경 을 사용하여 지질 이중 층의 표면에 텍사스 레드의 신호를 관찰하여 모니터링하였다. 막 지질 탈혼합 또는 혈전은 지질 두 층으로 확산된 지질 마커로서 텍사스 레드를 통해 모니터링되었다. Calcein de-quenching은 전체 융합 모공 형성을 지질 드믹싱과 구별하는 데 도움을 주었으며, 입자가 혈중 혈중으로 정체되는 조건과 전체 융합으로 진행되는 입자 간의 비교를 가능하게 했습니다.
멤브레인 테더링은 지질 및 유출 신호로부터 의 안정적인 지질 신호로 칼세인 신호에 담금질이 없음을 특징으로 하지만, 텍사스 적신호의 급속한 붕괴는 지질 이중층으로 염료의 확산을 나타냈다. 전체 융합은 지질 부패와 콘텐츠 릴리스를 모두 특징으로합니다. 이 입자를 시도할 때는 높은 품질의 이중 층이 제작되도록 커버글래스와 랭뮤어 트로프를 모두 철저히 청소해야 합니다.
우수한 공기 질은 또한 이중 층의 결함을 방지하기 위해 중요합니다. 이 기술은 미토콘드리아 막 역학 및 조직에서 새로운 질문을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다. 흥미로운 미래 실험은 미토콘드리아 내막 역학에서 이중 층 비대, 막 잠재력 및 질병 관련 돌연변이의 영향을 탐구하는 것을 포함합니다.
