يصف هذا البروتوكول نموذجا تجريبيا فريدا من الاضطرابات اللاإرادية من خلال تحديد طريقة تحفيز التشنجات اللاإرادية الحركية في فأر يتصرف بحرية ، إما بطريقة عابرة أو مزمنة. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تصف النموذج الوحيد المتاح للتعبير عن التشنج اللاإرادي ، والذي يستخدم على نطاق واسع لدراسة متلازمة توريت وغيرها من الاضطرابات اللاإرادية. توضح العرض البصري العملية المعقدة لإعداد الجهاز حسب الطلب وجراحة الزرع.
إثبات الإجراء سيكون استير فينر، طالبة دراسات عليا من مختبري، وكاتيا بيليلوفسكي، مديرة المختبر. للبدء، وإعداد قنية زرع عن طريق قطع 25 قياس هيبوب الفولاذ المقاوم للصدأ و0.013 بوصة دمية الأسلاك الداخلية القابلة للإزالة. أدخل هذا السلك الوهمي في قنية الزرع حتى تصل إلى النهاية وثني السلك الزائد.
ثم قطع 70 سنتيمترا مرنة البوليمر microbore أنبوب لإعداد حاقن. إعداد قنية حقن عن طريق قطع 30 قياس هيتوب الفولاذ المقاوم للصدأ مع أداة دوارة. إدراج ثلاثة ملليمترات من هذه القنية الحقن في أنبوب مرن، والغراء المفصل بينهما للحصول على حاقن.
عند إجراء الجراحة، قم بتمرير الزرع على حامل القنية وخفضه إلى هدف الزرع في دماغ الجرذ. إرفاق القنية المزروعة إلى جمجمة الجرذ عن طريق تطبيق أسمنت الأسنان. أدخل الدمية المعدة في هذه القنية المزروعة وغط جميع الغرسات عن طريق تطبيق أسمنت الأسنان على بقية منطقة الجمجمة.
لإجراء الميكروجينكشن، قم بإرفاق المحقن بالميكروسرينج الزجاجي الدقيق المليء بالبيكوكلين وتكوين الإعدادات بمعدل 0.35 ميكرولتر في الدقيقة وحجم إجمالي قدره 0.35 ميكرولتر. ضع الجرذ في القفص التجريبي إزالة دمية وإدراج حاقن في القنية المزروعة من خلال نهاية المطاف.
بدء ضخ مضخة الجهاز وتتبع بدء التشنج وإنهاء مرات باستخدام ساعة توقيت. بعد دقيقة واحدة من الحقن، قم بإزالة المحقن وأعد إدخال الدمية ببطء. إعداد دليل cannula عن طريق قطع 12 ملليمتر 25 قياس الفولاذ المقاوم للصدأ hypotube وقنية ضخ عن طريق قطع 30 قياس الفولاذ المقاوم للصدأ hypotube.
إدراج سلك قطرها 0.005 بوصة في قنية التسريب وثنيه في شكل L في الموقع المقصود. بعد ذلك، قم بإعداد أنابيب قسطرة مرنة عن طريق قطع أنبوب البولي إيثيلين PE10 طوله ثمانية سنتيمترات. إزالة السلك الداخلي من قنية التسريب، الغراء دليل القنية على التداخل ثلاثة ملليمتر بالقرب من الجزء عازمة من قنية التسريب باستخدام الغراء cyanoacrylate والمسرع.
ثم أدخل الجزء الأفقي من قنية التسريب على أنابيب القسطرة. إخراج الغطاء الشفاف لمشرف تدفق المضخة. تزج محول أنابيب في الكحول 70٪، وإرفاقه إلى الجزء القنية قصيرة من تدفق مشرف حتى يمس شفة بيضاء.
أدخل أنابيب القسطرة المرنة في محول الأنابيب واحمل جزء القنية الطويل باستخدام حامل مشبك أثناء لصق جميع الاتصالات. قم بلف المضخة التناضحية المصغرة بمسح الورق وأصلحها عموديا مع الفتحة التي تواجه لأعلى باستخدام حامل مشبك. ملء المضخة مع aCSF باستخدام حقنة مع إبرة حادة قياس 27، مع الحرص على تجنب دخول الهواء.
ملء الجزء القنية طويلة من أنبوب التسريب مع aCSF باستخدام حقنة مع إبرة حادة قياس 27. وأدخله في المضخة. ضع المضخة في كوب ملحي لمدة أربع إلى ست ساعات على الأقل عند 37 درجة مئوية.
إنشاء جيب تحت الجلد في ظهر الجرذ عن طريق فتح وإغلاق الهموستات المعقمة الكحول تحت الجلد من خلال خط الكتف الأوسط. إزالة المضخة من حمام الماء ووضعها على الفئران مرة أخرى مغطاة مسح ورقة. الشريحة التي دليل cannula من أنبوب التسريب على حامل القنية.
عقد المضخة مع hemostat وإدراجه بلطف في جيب تحت الجلد. زرع قنية التسريب في الهدف والغراء على الجمجمة باستخدام الغراء هلام. إصلاح قنية التسريب، وضمان أن القسطرة خالية من مكامن الخلل للسماح لحركة الرقبة وتغطية جميع يزرع مع أسمنت الأسنان.
لإجراء جراحة استبدال المضخة، ابدأ في حقن بيكوكلين في المضخة باستخدام حقنة مع إبرة حادة قياس 27. استمر في حقن البيكوكلين أثناء إزالة الحقنة لمنع الهواء من الدخول. أدخل مشرف التدفق داخل المضخة وضع المضخة في كوب ملحي لمدة أربع إلى ست ساعات على الأقل في حمام مائي 37 درجة مئوية.
إجراء شق على الجلد فوق مضخة مزروعة. غسل الجيب مع درجة حرارة الغرفة aCSF وتجفيفه مع منصات الشاش. فصل مضخة aCSF مملوءة من وسيط التدفق باستخدام hemostat وتجاهله.
وبالمثل، فصل وتجاهل وسيط التدفق من مضخة مليئة bicuculline. إرفاق بلطف مضخة مليئة bicuculline إلى وسيط تدفق المزروعة والغراء خط شق مع لاصقة الأنسجة. في النموذج الحاد ، تبدأ التشنجات اللاإرادية في الظهور بعد عدة دقائق من الميكولينيكين الدقيق وتستمر لعشرات الدقائق ثم تتحلل وتتوقف في نهاية المطاف.
في النموذج المزمن ، تبدأ العرات عادة في الظهور في اليوم الأول بعد زرع المضخة المملوءة بالبيكولين ، والتي تتقلب خلال النهار ويمكن ملاحظتها بشكل واضح خلال حالة الاستيقاظ الهادئة. التشنجات اللاإرادية الحركية لديها توقيع الحركية النمطية التي يمكن الكشف عنها في التسارع وإشارات جيروسكوب. وبالمثل، يمكن أيضا تقييم توقيت تيك باستخدام الحقول المحلية إشارة المحتملة في جميع أنحاء مسار العقدة القشرية القاعدية بسبب ظهور مسامير LFP واسعة عابرة.
مكنت هذه النماذج من دراسة التعبير التشنجي بعد تدخلات سلوكية وبيئية ودوائية مختلفة لفترات طويلة من الزمن.
