우리의 프로토콜은 연구원이 명확하고 쉽게 추적 할 수있는 방식으로 혈관 네트워크 형성 과정을 연구 할 수 있습니다, 새로운 연구에 문을 열고 혈관 행동에 빛을 흘리. 이 기술은 주변 환경에 반응하여 고도로 조직되고 반복 가능한 혈관 네트워크를 만들 수 있는 가능성을 제시합니다. 혈관 질환을 앓고있는 환자로부터내피 세포는이 시스템을 사용하여 회수 할 수 있으므로 혈관 질환을 재현하고 적절한 치료를 찾을 수 있습니다.
제안된 방법은 다른 세포 모형과 결합될 때 혈관 네트워크 행동을 공부하기 위한 확장될 수 있고, 특정 조직 모형을 가진 발전 선박의 상호 작용을 관찰하는 것을 허용합니다. 비계를 70%에 잠은 것으로 시작하여 최소 15분 동안 비계를 잠은 다음 PBS에서 두 번 세척합니다. 1.5 마이크로리터의 fibronectin 스톡 용액을 스캐폴드 당 PBS 28.5 마이크로리터와 혼합하여 시드를 드시면 됩니다.
파이펫팅 오류를 피하기 위해 모든 스캐폴드에 사용할 하나의 fibronectin 희석을 준비합니다. 스캐폴드를 소수성 표면 위에 희소하게 놓고 각 비계를 섬유넥틴 희석의 30 마이크로리터로 덮습니다. 플레이트뚜껑을 교체하고 섬유네틴으로 덮인 비계를 섭씨 37도, 습도 100%로 설정된 인큐베이터에 최소 1시간 동안 넣습니다.
잠복 후 PBS에서 비계를 가볍게 헹구어 섬유네틴 잔재를 제거합니다. 비계는 PBS에서 최대 1주일 동안 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다. 제조업체에 의해 표시된 바와 같이 항생제 용액, FBS 및 내피 세포 성장 보충제를 포함하는 해당 배지 키트 성분과 기저 배지를 혼합하여 내피 세포 또는 EC 배지를 준비한다.
밀리리터 당 4백만 개의 세포 농도로 EC 배지에서 인간 지방 미세 혈관 내피 세포 현탁액을 만듭니다. 집게를 사용하여 TC 24웰이 아닌 플레이트에 잘 1개의 섬유네틴 코팅 비계를 놓습니다. 각 스캐폴드를 셀 서스펜션의 25 마이크로리터 방울로 덮어 서스펜션이 스캐폴드에서 흘러나가지 않도록 하십시오.
뚜껑을 접시에 놓고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 100%로 60~90분간 인큐베이터에 넣습니다. 인큐베이션 후, EC 배지의 700 마이크로리터로 각 우물을 채웁니다. EC 합류가 형광 현미경 검사를 사용하거나 3 일 동안 관찰 될 때까지 내피 비계를 배양하십시오.
격일로 매체를 변경합니다. 낮은 포도당 DMEM의 500 밀리리터, FBS의 57.5 밀리리터, 비필수 아미노산의 5.75 밀리리터, 글루타맥스의 5.75 밀리리터, 5.75 밀리리터의 페니실린-연쇄절제술-니스타틴 용액을 혼합하여 DPSC 배지를 준비하십시오. 내피비슬리드 비계를 새로운 비TC 24웰 플레이트로 옮킨다.
스캐폴드에 진공을 직접 바르지 않도록 주의하여 파이펫 또는 진공 흡입을 사용하여 현재 플레이트의 모든 미디어를 폐기하십시오. 각 우물의 중앙에 비계 1개를 넣은 다음 가벼운 진공으로 주변 지역을 건조시다. PBS로 혈소및 피브리노겐 스톡 솔루션을 밀리리터당 5단위, 밀리리터당 15밀리그램의 최종 농도로 희석합니다.
혈소판 희석에서 밀리리터 서스펜션당 800만 DPSC를 준비하고 12.5마이크로리터의 현탁액을 스캐폴드 당 개별 마이크로튜브에 분배하여 종자를 한다. 5-50 마이크로리터 파이펫을 12.5 마이크로리터로 설정하고 피브리노겐 용액으로 채웁니다. 팁을 제거하지 않고 파이펫을 25 마이크로리터로 설정합니다.
팁의 재질은 상승하여 빈 볼륨을 남겨두어야 합니다. 액체가 팁 개구부에 도달할 때까지 플런저 버튼을 천천히 누르지만 누출되지 않습니다. 플런저를 이 위치에 놓고 팁을 혈전 현탁액에 있는 세포를 포함하는 마이크로센트심분리기 튜브 중 하나에 넣어 팁이 액체와 접촉하고 있는지 확인합니다.
플런저 버튼을 부드럽게 풀어 서 셀 서스펜션을 팁에 그립니다. 두 재료를 철저히 혼합하여 거품 형성을 피하십시오. 내피비폴드 위에 혼합 재료를 신속하게 분배합니다.
각 스캐폴드에 대한 이전 단계를 반복하여 팁 내에서 예기치 않은 피브린 젤 형성을 피하기 위해 사용 간에 팁을 변경해야 합니다. 플레이트 뚜껑을 교체하고 비계를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 100%로 30분간 인큐베이션합니다. 인큐베이션 후 일대일 DPSC 및 EC 배지의 1밀리리터로 각 웰을 채웁니다.
1 주일 동안 문화, 격일로 매체를 변경합니다. 배양 시 상이한 시점에서, 혈관 발달 또는 기타 관심 있는 파라미터를 연구하기 위해 공초점 현미경을 이용하여 우물에서 배지를 제거하고 구문들을 이미지한다. 이 프로토콜은 SU-8 포토레지스트로 만든 테셀레이션 스캐폴드를 제조할 수 있습니다.
뚜렷한 구획 형상과 매우 정확하고 반복 가능한 피쳐가 있는 스캐폴드를 획득했습니다. 내피 세포와 지지 세포 모두의 전통적인 동시 파종으로 세포는 스캐폴드에 균질적으로 분포되어 예측할 수 없는 조직화된 혈관 네트워크를 생성했습니다. 반대로, 단계별 세포 파종은 고도로 조직화된 혈관 네트워크를 초래했습니다.
형광 내피 세포를 사용하는 경우 혈관을 실시간으로 배분 할 수 있습니다. 내피 세포를 발현하는 적색 형광 단백질은 육각형 비계에서 배양되고 이미지되었다. 지원 세포는 첫날에 추가되었고 혈관 네트워크는 선박 개발을 정량화하기 위해 격일로 이미지화되었습니다.
매 시간 마다 전체 비계의 넓은 이미지가 촬영되었습니다. 선박의 성장은 총 선박 길이 및 면적으로 정량화되었다. 공초점 이미징 시간 경과는 다색 내피 세포를 사용하여 단일 혈관 추적을 허용하기 위해 수행되었다.
선박 경로는 시간 경과에서 생성되어 선박 이주를 관찰할 수 있게 되었습니다. 혈관 성숙은 부드러운 근육 액틴 및 지지 세포의 존재에 의해 관찰되었다. 원형, 육각형 및 제곱 구획의 경우 세포가 번식하여 구조로 구성됩니다.
7일째가 되면 모든 모양이 풍부하고 복잡한 혈관 네트워크를 보였습니다. 배율상상에서는 형성된 혈관과 공동국화된 조밀한 원평근육 액틴 및 지지 세포 존재, 혈관 구조를 둘러싼 지지세포 모집 및 분화를 공고하게 하였다. 이 기술은 특정 세포 억제제와 같은 다른 조건에 노출될 때 또는 추가 세포 모형의 존재에서 3차원 혈관 네트워크의 동작을 연구하기 위하여 이용될 수 있다.
