يحدد هذا البروتوكول جيلنا من عضويات الأوعية الدموية البشرية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات. يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة جوانب تكوين الأوعية الدموية ، تولد الأوعية الدموية ، أمراض الأوعية الدموية ، وكذلك أمراض الأوعية الدموية. تعد قابلية التكاثر وطبيعة الإنتاجية العالية ، بالإضافة إلى اتساقها عبر العديد من خطوط الخلايا الجذعية المختلفة ، مزايا قوية لهذه التقنية.
من حيث تطبيقها ، تحدد بعض أبحاثنا السابقة استخدام عضويات الأوعية الدموية لدراسة التغيرات المورفولوجية للأوعية الدموية لمرضى السكري وتستكشف طرق العلاج الدوائي لاعتلال الأوعية الدموية السكري. الحفاظ بشكل صحيح على عدد الخلايا الجذعية الأولية ، ومنع الركام من التكتل ، وضمان قطر إجمالي شبه متجانس ، هذه عوامل أساسية لتوليد عضويات الأوعية الدموية الجيدة. ابدأ توليد الركام باستخدام الخلايا الجذعية البشرية المستزرعة متعددة القدرات ، أو hPSCs ، التي لها التقاء بنسبة 70٪.
باستخدام ماصة أو نظام تفريغ ، قم بنضح وسط المزرعة واستبدله بمليلتر واحد من كاشف تفكك الخلايا قبل احتضان الخلايا لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد الحجم اللازم لوسط التجميع في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر ، باتباع الصيغة المذكورة في مخطوطة النص. بعد احتضان الخلايا ، قم بنضح كاشف تفكك الخلية قبل تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من وسط التجميع.
قم بسحب المحتوى برفق لأعلى ولأسفل لإنشاء تعليق أحادي الخلية. عد الخلايا باستخدام جهاز عد الخلايا الآلي أو تحت المجهر ، واحسب العدد الإجمالي للخلايا المطلوبة لتشكيل الركام. تظهر قراءات صلاحية الخلية تعليق خلية واحدة مع مجموعات منخفضة أو معدومة.
قم بنضح المادة الطافية من الأنبوب وأضف الحجم المناسب من تعليق الخلية إلى وسط التجميع في الأنبوب المخروطي عالي الوضوح من مادة البولي بروبيلين سعة 15 ملليلتر وماصة تعليق الخلية المخففة برفق لأعلى ولأسفل لضمان توزيع متجانس للخلايا. ماصة ثلاثة ملليلتر من تعليق الخلية المخففة في كل بئر مرغوب فيه من لوحة ثقافة التعلق المنخفضة للغاية المكونة من ستة آبار. ضع اللوحة في الحاضنة وقلل من أي إزعاج للحفاظ على حجم وشكل الركام.
تحضير وسائط الأديم المتوسط كما هو موضح في مخطوطة النص. بعد 24 ساعة من بذر الخلايا ، أخرج صفيحة الثقافة من الحاضنة. قم بتدوير اللوحة بحركة دائرية لتجميع الركام في وسط كل بئر.
باستخدام ماصة سعة ملليلتر واحد ، انقل الركام برفق مع الوسيط من كل بئر إلى الأنبوب المخروطي المقابل. اترك الركام يترسب في الأنابيب المخروطية في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بمجرد ترسيبها ، قم بنضح المادة الطافية باستخدام ماصة أو مضخة شفط عالية الحساسية بحذر ، دون الإخلال بالركام المستقر.
أعد تعليق الركام في كل أنبوب بإضافة ملليلتر من وسط تحريض الأديم المتوسط. بعد ذلك ، انقل التعليق من كل أنبوب مرة أخرى إلى البئر المعني بلوحة الاستزراع ذات الستة آبار ذات التعلق المنخفض للغاية. ضع الطبق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية واتركه حتى اليوم الرابع.
في اليوم الرابع ، أخرج لوحة الاستزراع من الحاضنة ، ثم هز اللوحة بحركة دائرية لجمع الركام في وسط كل بئر. باستخدام ماصة سعة ملليلتر واحد ، انقل الركام برفق مع الوسط المحيط من كل بئر إلى الأنبوب المخروطي المقابل. اضبط مؤقتا لمدة 30 دقيقة للسماح للركام بالترسبات في الأنابيب.
بمجرد ترسب الركام ، قم بإعداد ألواح الاستزراع كما هو موضح سابقا ووضعها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية حتى اليوم السادس. لتضمين الركام وتحريض تنبت الوعاء ، قم بإعداد الحجم النهائي المطلوب لمحلول المصفوفة خارج الخلية أثناء العمل على الجليد. ماصة 500 ميكرولتر من ECM في بئر واحد من لوحة 12 بئر لتشكيل الطبقة الأولى من شطيرة ECM.
لضمان البلمرة الفعالة لطبقة ECM الأولى ، ضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. قرب نهاية الحضانة لمدة ساعتين ، ابدأ العمل مع الركام في لوحة الثقافة. اجمع الركام في وسط كل بئر قبل استخدام ماصة سعة ملليلتر واحد لنقل الركام والوسط برفق من كل بئر إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.
اترك الركام يستقر لمدة 10 إلى 15 دقيقة قبل استنشاق المادة الطافية. بعد ذلك ، احتفظ بالأنابيب المخروطية التي تحتوي على الركام على الجليد لمدة خمس دقائق. العمل بسرعة وبعناية ، أعد تعليق الركام في 500 ميكرولتر من ECM دون تكوين فقاعة.
باستخدام ماصة ، ضع طبقة من تعليق ECM الكلي فوق طبقة ECM الأولى المبلمرة بالفعل داخل البئر في لوحة 12 بئرا. في غضون ذلك ، قم بإعداد وسيط الإنبات كما هو موضح في مخطوطة النص. بعد ساعتين من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، أضف ملليلترا واحدا من وسط النبتة المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية في البئر للحث على تمايز الأوعية الدموية.
العمل في ظل ظروف معقمة ، استخدم الطرف المستدير لملعقة معقمة لتخفيف مصفوفة تنبت ECM التي تحتوي على شبكات الأوعية الدموية. ثم ، باستخدام ملقط معقم ونهاية مستديرة لملعقة معقمة ، انقل قرص الهلام المفكك بعناية إلى غطاء طبق استزراع 10 سم. ضع الجل على الغطاء تحت مجهر ستيريو مضبوط على التكبير والتركيز المطلوبين ، واستخدم الإبر المعقمة لقطع شبكات الأوعية الدموية المفردة ، في محاولة للحد من كمية ECM غير الوعائية التي تم الحصول عليها في هذه العملية.
انقل المواد العضوية المعزولة برفق مرة أخرى إلى بئر واحدة من صفيحة ذات ستة آبار منخفضة للغاية تحتوي على ثلاثة ملليلتر من وسط الإنبات. بعد ذلك ، باستخدام ماصة سعة ملليلتر واحد ، قم بنقل المواد العضوية المفردة إلى العدد المناسب من الآبار في لوحة 96 بئر منخفضة للغاية. بمجرد النقل ، أضف 200 ميكرولتر من وسط النبتة المسخن مسبقا في كل بئر من لوحة 96 بئرا.
بعد أربعة إلى ستة أيام من العزل في اللوحة المكونة من 96 بئرا ، تأكد من أن المواد العضوية تمتلك مورفولوجيا مستديرة وصحية قبل الشروع في إصلاحها وتلطيخها. تم التقاط صور للتقدم التدريجي للجيل العضوي للأوعية الدموية البشرية ، أو hBVO ، من hPSCs تحت المجال الساطع. في اليوم صفر ، تم إنشاء مجاميع يتراوح قطرها من 30 إلى 100 ميكرون من ثقافة hPSC.
لوحظت تغييرات طفيفة في حجم وشكل الركام عند تحريض الأديم المتوسط في اليوم الأول ، والتي تغيرت أكثر في اليوم الرابع حيث خضعت الركام لتحضير الأوعية الدموية. يمكن ملاحظة نبت الأوعية المبكرة شبه المتماثلة شعاعيا في اليوم السابع ، بعد يوم من تضمين الركام في مصفوفة الإنبات. شوهد مورفولوجيا عضوية صحية واستمرار تنبت الأوعية في اليوم التاسع ، والذي تقدم إلى أوعية المرحلة المتأخرة التي تنبت بحلول اليوم 10 عندما اختفت هياكل الخلايا الكثيفة في مركز الأعضاء تقريبا.
لوحظ بوضوح مورفولوجيا نموذجية لعضويات الأوعية الدموية البشرية الناضجة بحلول اليوم 15. أظهر تلطيخ كامل لل hBVOs الناضجة في اليوم 15 شبكة بطانية واسعة النطاق ومتصلة كانت إيجابية CD31 ومحاطة بطفيليات إيجابية PDGFR-beta وأكتين عضلي ألفا أملس إيجابي SMA. تمت ملاحظة الخلايا الجدارية الإيجابية PDGFR-beta و SMA الإيجابية التي تغلف شبكات الأوعية البطانية جيدا.
كما لوحظ وجود غشاء قاعدي مستمر إيجابي للكولاجين الوريدي يغلف شبكات الأوعية. يعد ضمان البلمرة المناسبة للمصفوفة خارج الخلية أثناء خطوة التضمين أمرا بالغ الأهمية لتنبت الأوعية الدموية بشكل فعال. استخدم الباحثون تقنية الأوعية الدموية العضوية الخاصة بنا لتوليد مقصورات الأوعية الدموية المبكرة في النماذج العضوية القائمة بالفعل ، مثل الدماغ والكلى ، والتي كانت في السابق الأوعية الدموية.
