هذا هو نموذج لأمراض الشبكية ويحاكي شبكية العين في الجسم الحي. إلى حد ما ، يمكن أن تحل محل التجارب على الحيوانات. تم تحسين البروتوكول لنوعية وكمية سلائف المستقبلات الضوئية في عضويات الشبكية ، والمستقبل الضوئي هو المفتاح للعديد من حالات العمى التي لا رجعة فيها.
ابدأ بزراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، أو hESCs ، في ظل ظروف خالية من التغذية. للقيام بذلك ، قم بتغطية بئر واحد من صفيحة من ستة آبار بملليلتر واحد من 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الكاشف A ، واحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة نصف ساعة على الأقل. قم بإذابة أليكوت من مليون hESCs ، وقم بطرده مركزيا عند 200 xg لمدة خمس دقائق.
بعد إزالة السوبرناتانت ، قم بزرع الخلايا في الصفيحة المطلية سابقا ، إلى جانب ملليلترين من الكاشف B.Passage الخلايا بعد الوصول إلى ما يقرب من 80٪ من الالتقاء في حوالي أربعة أيام. بعد الوصول إلى الالتقاء ، اغسل الخلايا باستخدام DPBS المسخن مسبقا ، وانقلها إلى 500 ميكرولتر من الكاشف الطازج. ثم ، احتضن الخلايا لمدة 3.5 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
افصل الخلايا عن طريق تحريك جانب وأسفل اللوحة لبضع ثوان ، وأضف 500 ميكرولتر من الميكرولتر المتوسط المحضر. حصاد الخلايا المنفصلة في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر ، وماصة تعليق الخلية لأعلى ولأسفل. لحساب الخلايا ، أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا إلى 900 ميكرولتر من DPBS.
قم بتخفيف 900 ميكرولتر من تعليق الخلية المتبقي مع واحد متوسط في طبق بتري لتحقيق تسع مرات 10 إلى خلايا الطاقة الرابعة لكل ملليلتر. أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا المخفف إلى كل بئر من صفيحة غير ملتصقة ، ذات قاع V ، 96 بئرا. قم بتدوير اللوحة برفق على شاكر منخفض السرعة لمدة خمس دقائق ، واحتضنها عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون حتى اليوم الثاني.
في اليوم الثاني ، أضف 20 ميكرولتر من الكاشف A بنسبة 1٪ إلى كل بئر من صفيحة البئر 96 ، وماصة مرتين في الوسط لتشتيت الخلايا الميتة. نظف الجزء السفلي من اللوحة قبل احتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون حتى اليوم السادس. في اليوم السادس ، استبدل 58 ميكرولتر من الوسط ب 60 ميكرولتر من الوسط الطازج ، واستمر في الحضانة.
في اليوم 12 ، قم بحصاد كريات الخلايا من صفيحة 96 بئرا في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر ، واسمح للكريات بالاستقرار بشكل طبيعي لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. عندما تستقر الكريات ، قم بإزالة supernatant دون إزعاج المواد العضوية ، ونقل مجاميع الخلايا إلى طبق معلق 10 سم يحتوي على 18 ملليلتر من الوسط الثاني مع كاشف A.احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى اليوم 18. في اليوم 18 ، تأكد من توليد حويصلة بصرية شبه شفافة في الطبق ، وقطع المواد العضوية المتولدة باستخدام سكين الجراحة المجهرية.
قم بتجميع جميع الكريات المقطوعة في وسط الطبق. ثم ، قم بحصاد الخلايا في أنبوب فالكون مخروطي 15 ملليلتر. عندما تستقر الخلايا ، قم بإزالة السوبرناتانت بلطف ، وأعد تعليق الكريات في طبقين بتري بطول 10 سنتيمترات مع 18 ملليلتر من الوسط ، ثلاثة لكل طبق.
انقل الأطباق بلطف إلى الحاضنة لتجنب تراكم الخلايا. استمر في زراعة الخلايا ، وتغيير الوسط أسبوعيا. تحليل تعبير CRX بعد اليوم 45 حتى اليوم 120.
في هذا التحليل التمثيلي ، يتم عرض مراحل مختلفة من توليد الشبكية البشرية. في اليوم السادس ، ظهرت المواد العضوية كمجموعة من الاتصالات الكثيفة داخل حافة مشرقة يبلغ قطرها حوالي 600 ميكرومتر. في اليوم 12 ، حدث الجيل الأولي من الهياكل الشبيهة بالحويصلة البصرية.
تم التخلص من المواد العضوية التي لا تحتوي على بنية مناسبة تشبه الحويصلة قبل الزراعة في طبق بتري في اليوم 18. بحلول اليوم 30 من الثقافة ، كانت الهندسة المعمارية الشبيهة بالحويصلة أكثر وضوحا ، ويمكن تمييز ROs الأدنى وإزالتها بسهولة. بدءا من اليوم 45 ، عبرت المواد العضوية عن علامات مختلفة لسلائف المستقبلات الضوئية ، مثل CRX و RCVRN و OTX2.
من خلال شق المواد العضوية الشبكية المتفوقة ، يتم تحسين كفاءة التمايز بشكل كبير ، ويمكن حصاد أكثر من 100 مادة عضوية متفوقة من 96 لوحة.
