Este é um modelo para a doença da retina e emula a retina in vivo. Até certo ponto, poderia substituir os experimentos com animais. O protocolo é otimizado para a qualidade e quantidade dos precursores fotorreceptores nos organoides da retina, e o fotorreceptor é a chave para várias condições irreversíveis de cegueira.
Comece por cultivar as células estaminais embrionárias humanas, ou hESCs, em condições livres de alimentadores. Para fazer isso, cubra um poço de uma placa de seis poços com um mililitro de 100 microgramas por mililitro de reagente A e incube a placa a 37 graus Celsius por pelo menos meia hora. Descongele uma alíquota de um milhão de hESCs e centrifuja-a a 200 xg por cinco minutos.
Após a remoção do sobrenadante, semeie as células na placa previamente revestida, juntamente com dois mililitros de reagente B.Passe as células depois de atingir aproximadamente 80% de confluência em torno de quatro dias. Depois de atingir a confluência, lave as células com DPBS pré-aquecido e transfira-as para 500 microlitros de reagente recém-preparado. Em seguida, incube as células por 3,5 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Retire as células agitando o lado e o fundo da placa por alguns segundos e adicione 500 microlitros de um meio preparado. Colha as células separadas em um novo tubo de 1,5 mililitro e pipete a suspensão celular para cima e para baixo. Para contagem de células, adicione 100 microlitros de suspensão celular a 900 microlitros de DPBS.
Diluir os 900 microlitros da suspensão celular restante com um meio na placa de Petri para atingir nove vezes 10 para a quarta célula de potência por mililitro. Adicione 100 microlitros de suspensão celular diluída a cada poço de uma placa de 96 poços não aderente, com fundo em V. Gire levemente a placa em um agitador de baixa velocidade por cinco minutos e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até o segundo dia.
No segundo dia, adicione 20 microlitros de 1% de reagente A a cada poço da placa de 96 poços e pipete duas vezes no centro para espalhar as células mortas. Limpe o fundo da placa antes de incubá-la a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até o sexto dia. No sexto dia, substitua 58 microlitros do meio por 60 microlitros de meio fresco e continue a incubação.
No dia 12, colha os pellets de células da placa de 96 poços em um tubo cônico de 15 mililitros e permita que os pellets se depositem naturalmente por cinco minutos à temperatura ambiente. Quando os pellets se assentarem, retire o sobrenadante sem perturbar os organoides e transfira os agregados celulares para um prato de suspensão de 10 centímetros contendo 18 mililitros de meio dois com o reagente A.Incube o prato a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até o dia 18. No dia 18, confirme a geração de uma vesícula óptica semitransparente no prato e corte os organoides gerados usando uma faca microcirúrgica.
Adicione todos os pellets cortados ao centro do prato. Em seguida, colha as células em um tubo de Falcão cônico de 15 mililitros. Quando as células se assentarem, remova suavemente o sobrenadante e ressuspenda os pellets em duas placas de Petri de 10 centímetros com 18 mililitros de meio, três por prato.
Transfira suavemente os pratos para a incubadora para evitar a agregação celular. Continue cultivando as células, mudando o meio semanalmente. Analise a expressão de CRX após o dia 45 até o dia 120.
Nesta análise representativa, vários estágios da geração da retina humana são exibidos. No sexto dia, os organoides apareceram como um agregado de conexões densas dentro de uma borda brilhante com um diâmetro de cerca de 600 micrômetros. No dia 12, ocorreu a geração inicial das estruturas ópticas semelhantes a vesículas.
Os organoides sem arquitetura adequada semelhante a uma vesícula foram descartados antes da cultura em uma placa de Petri no dia 18. No dia 30 da cultura, a arquitetura semelhante a uma vesícula era mais óbvia, e as ROs inferiores podiam ser facilmente distinguidas e removidas. A partir do dia 45, os organoides expressaram vários marcadores de precursores fotorreceptores, como CRX, RCVRN e OTX2.
Ao clivar os organoides superiores da retina, a eficiência de diferenciação é significativamente melhorada e mais de 100 organoides superiores de 96 placas podem ser colhidos.
