これは網膜疾患のモデルであり、生体内網膜をエミュレートします。ある程度、それは動物実験に取って代わる可能性があります。このプロトコルは、網膜オルガノイド中の光受容体前駆体の質と量に最適化されており、光受容体はいくつかの不可逆的な失明状態の鍵となります。
まず、ヒト胚性幹細胞(hESC)をフィーダーフリー条件下で培養します。これを行うには、6ウェルプレートの1ウェルに1ミリリットルの試薬Aあたり1ミリリットルの100マイクログラムをコーティングし、プレートを摂氏37度で少なくとも30分間インキュベートします。100万hESCのアリコートを解凍し、200 xgで5分間遠心分離します。
上清を除去した後、約4日で約80%のコンフルエントに達した後、2ミリリットルの試薬B.Passageとともに、細胞を以前にコーティングしたプレートに播種します。コンフルエントに達した後、予熱したDPBSで細胞を洗浄し、500マイクロリットルの新たに調製した試薬に移します。次に、摂氏37度と5%二酸化炭素で3.5分間細胞をインキュベートします。
プレートの側面と底面を数秒間フリックして細胞を剥離し、500マイクロリットルの準備した培地を加えます。剥離した細胞を新しい1.5ミリリットルのチューブに回収し、細胞懸濁液を上下にピペットで固定します。細胞計数のために、900マイクロリットルのDPBSに100マイクロリットルの細胞懸濁液を加える。
残りの細胞懸濁液の900マイクロリットルをペトリ皿内の培地1で希釈して、ミリリットルあたり9倍の10〜4パワーセルを達成します。100マイクロリットルの希釈細胞懸濁液を、非接着性のV底96ウェルプレートの各ウェルに加える。低速シェーカーでプレートを5分間軽く回転させ、摂氏37度、二酸化炭素5%で2日目までインキュベートします。
2日目に、96ウェルプレートの各ウェルに20マイクロリットルの1%試薬Aを加え、中央で2回ピペットで死細胞を散布します。プレートの底をきれいにしてから、摂氏37度と5%の二酸化炭素で6日目までインキュベートします。6日目に、58マイクロリットルの培地を60マイクロリットルの新しい培地1と交換し、インキュベーションを続けます。
12日目に、15ミリリットルのコニカルチューブ内の96ウェルプレートから細胞ペレットを回収し、ペレットを室温で5分間自然に沈降させます。ペレットが落ち着いたら、オルガノイドを乱すことなく上清を取り除き、細胞凝集塊を試薬Aを含む18ミリリットルの培地2を含む10センチメートルの懸濁皿に移し、18日目まで摂氏37度、二酸化炭素5%で培養します。18日目に、ディッシュ内の半透明視神経小胞の生成を確認し、マイクロサージカルナイフを用いて生成したオルガノイドを切断した。
カットしたペレットをすべて皿の中央に集約します。次に、細胞を15ミリリットルの円錐形のファルコンチューブに収穫します。細胞が落ち着いたら、上清を静かに取り除き、1皿あたり3つずつ、18ミリリットルの培地を入れた2つの10センチメートルペトリ皿にペレットを再懸濁します。
細胞凝集を避けるために皿をインキュベーターにそっと移します。細胞を培養し続け、毎週培地を交換します。45日目から120日目までのCRX発現を分析します。
この代表的な解析では、ヒト網膜生成の様々な段階が表示される。6日目に、オルガノイドは直径約600マイクロメートルの明るい縁の内側に密集した接続の集合体として現れました。12日目に、視神経小胞様構造の初期生成が起こった。
適切な小胞様構造を持たないオルガノイドは、18日目にペトリ皿で培養する前に廃棄されました。培養の30日目までに、小胞のような構造はより明白になり、劣ったROは簡単に区別して除去することができました。45日目から、オルガノイドはCRX、RCVRN、OTX2などの光受容体前駆体のさまざまなマーカーを発現しました。
優れた網膜オルガノイドを切断することにより、分化効率が大幅に向上し、96枚のプレートから100を超える優れたオルガノイドを回収することができました。
