Bu retina hastalığı için bir modeldir ve in vivo retinayı taklit eder. Bir dereceye kadar, hayvan deneylerinin yerini alabilir. Protokol, retinal organoidlerdeki fotoreseptör öncüllerinin kalitesi ve miktarı için optimize edilmiştir ve fotoreseptör, birkaç geri dönüşümsüz körlük koşulunun anahtarıdır.
İnsan embriyotik kök hücrelerini veya hESC'leri besleyicisiz koşullar altında kültürleyerek başlayın. Bunu yapmak için, altı delikli bir plakanın bir kuyuğunu mililitre reaktif A başına bir mililitre 100 mikrogram ile kaplayın ve plakayı en az yarım saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir milyon hESC'lik bir aliquot'u çözün ve beş dakika boyunca 200 xg'de santrifüj yapın.
Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücreleri önceden kaplanmış plakaya, iki mililitre reaktif B. ile birlikte tohumlayın.Yaklaşık dört günde yaklaşık% 80 akıcılığa ulaştıktan sonra hücreleri geçirin. Akıcılığa ulaştıktan sonra, hücreleri önceden ısıtılmış DPBS ile yıkayın ve 500 mikrolitre taze hazırlanmış reaktife aktarın. Daha sonra, hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 3,5 dakika inkübe edin.
Plakanın yan ve alt kısımlarını birkaç saniye hareket ettirerek hücreleri ayırın ve 500 mikrolitre hazırlanmış orta olanı ekleyin. Ayrılan hücreleri 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe toplayın ve hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre sayımı için, 900 mikrolitre DPBS'ye 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.
Kalan hücre süspansiyonunun 900 mikrolitresini, mililitre başına dokuz kez 10 ila dördüncü güç hücresi elde etmek için Petri kabındaki orta bir mikrolitre ile seyreltin. Yapışmayan, V tabanlı, 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 100 mikrolitre seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin. Plakayı beş dakika boyunca düşük hızlı bir çalkalayıcıda hafifçe döndürün ve ikinci güne kadar 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
İkinci günde, 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 20 mikrolitre% 1 reaktif A ekleyin ve ölü hücreleri dağıtmak için merkezde iki kez pipet ekleyin. Plakanın dibini altıncı güne kadar 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe etmeden önce temizleyin. Altıncı günde, ortamın 58 mikrolitresini 60 mikrolitre taze ortamla değiştirin ve inkübasyona devam edin.
12. günde, hücre peletlerini 96 kuyucuklu plakadan 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın ve peletlerin oda sıcaklığında beş dakika boyunca doğal olarak yerleşmesine izin verin. Peletler çöktüğünde, organoidleri rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve hücre agregalarını, reaktif A ile 18 mililitre orta iki içeren 10 santimetrelik bir süspansiyon kabına aktarın. 18. günde, çanakta yarı saydam bir optik vezikülün oluşumunu onaylayın ve üretilen organoidleri mikrocerrahi bir bıçak kullanarak kesin.
Tüm kesilmiş peletleri kabın ortasına toplayın. Ardından, hücreleri 15 mililitrelik konik bir Falcon tüpüne toplayın. Hücreler yerleştiğinde, süpernatanı yavaşça çıkarın ve peletleri, her tabak için üç tane olmak üzere 18 mililitre orta ile iki adet 10 santimetrelik Petri kabında yeniden askıya alın.
Hücre kümelenmesini önlemek için bulaşıkları yavaşça inkübatöre aktarın. Hücreleri kültürlemeye devam edin, ortamı haftalık olarak değiştirin. CRX ifadesini 45. günden 120. güne kadar analiz edin.
Bu temsili analizde, insan retina üretiminin çeşitli aşamaları görüntülenir. Altıncı günde, organoidler yaklaşık 600 mikrometre çapında parlak bir jant içinde yoğun bağlantıların bir toplamı olarak ortaya çıktı. 12. günde, optik vezikül benzeri yapıların ilk nesli gerçekleşti.
Uygun vezikül benzeri mimariye sahip olmayan organoidler, 18. günde bir Petri kabında kültürlenmeden önce atıldı. Kültürün 30. gününde, vezikül benzeri mimari daha belirgindi ve daha düşük RO'lar kolayca ayırt edilebilir ve çıkarılabilirdi. 45. günden başlayarak, organoidler CRX, RCVRN ve OTX2 gibi fotoreseptör öncüllerinin çeşitli belirteçlerini ifade ettiler.
Üstün retinal organoidleri parçalayarak, farklılaşma verimliliği önemli ölçüde artar ve 96 plakadan 100'den fazla üstün organoid toplanabilir.
