يمكن لهذا البروتوكول أن يحسن بشكل كبير من توسع الخلايا القاتلة الطبيعية الوظيفية وغير الشاملة والشبيهة بالذاكرة خارج الجسم الحي مقارنة بخلايا التغذية الأخرى القائمة على نظام التوسع. هذه طريقة أبسط مقارنة بالبروتوكولات الأخرى التي تستخدم خلايا التغذية التي نتخطى فيها خطوة عزل الخلايا القاتلة الطبيعية قبل توسيع الخلايا القاتلة الطبيعية. يمكن أن يوفر هذا البروتوكول عددا كافيا من الخلايا القاتلة الطبيعية و CAR-NK للعلاج المناعي.
هذه التقنية قابلة للتكرار بشكل كبير. ومع ذلك ، فإن استخدام مواد أولية جديدة وجديدة والحرص على عدم إزعاج الخلايا القاتلة الطبيعية خلال الأيام القليلة الأولى من التوسع أمر بالغ الأهمية. ابدأ بتحديد وتقسيم مناطق الأنسجة القابلة للحياة باستخدام معدات جراحية معقمة للحصول على الخلايا الليمفاوية.
بعد ذلك ، ضع الأنسجة المقسمة في 30 ملليلتر من HBSS بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم واحتفظ بالأنسجة على الثلج حتى تصبح جاهزة للعزل. العمل داخل خزانة السلامة الحيوية ، فرم الأنسجة إلى مكعبات أقل من 0.5 سم مع شفرات حلاقة معقمة وملقط. ضع قطع الأنسجة المفرومة ، التي لا تزيد عن 4 غرامات ، في أنابيب فك الأنسجة وأضف 10 ملليلتر من كولاجيناز IV إلى قطع الأنسجة.
لفرم الأنسجة جيدا ، عالج أنابيب تفكيك الأنسجة في مفكك الأنسجة عند 37 درجة مئوية. بعد إزالة الأنابيب من مفكك الأنسجة ، قم بسحن الأنسجة المفرومة من خلال مصفاة خلايا نايلون 40 ميكرون باستخدام الواجهة الخلفية لحقنة سعة 5 ملليلتر. تخلص من الشظايا الكبيرة غير المهضومة.
قم بتدوير المادة المجمعة عند 400 جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة واستنشاق المادة الطافية قبل إعادة تعليق كريات الخلية في 30٪ من السيليكا المطلية بالبولي فينيل بيروليدون لإزالة الخلايا الدهنية. قم بتدوير الخلايا كما هو موضح قبل إعادة تعليق حبيبات الخلية في 9 ملليلتر من وسائط R-10. لفصل الخلايا الليمفاوية عن خلايا الدم الحمراء والخلايا متعددة الأشكال النووية ، ضع بعناية تعليق الخلية على 4 ملليلتر من وسائط فصل Ficoll أو الخلايا اللمفاوية.
افصل الطبقات عن طريق الطرد المركزي عند 400 جرام لمدة 23 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع إيقاف التسارع والفرامل. بعد ذلك ، صب الطبقة العليا والمتوسطة بعناية واحصد الطور البيني الذي يحتوي على الخلايا الليمفاوية المتسللة إلى الأنسجة. شطف الخلايا مع 10 ملليلتر من وسائل الإعلام والمضي قدما للتحليل أو القاتل الطبيعي الأساسي ، أو NK ، بروتوكول توسيع الخلايا.
اغسل خلايا الدم الطرفية أحادية النواة ، أو PBMCs ، و 100 خلية 221-mIL-21 مشععة بأشعة جاما بشكل منفصل عن طريق الطرد المركزي عند 400 جرام لمدة 5 دقائق باستخدام 10 ملليلتر من وسائط R-10. بعد الطرد المركزي ، احفظ 1 × 10 إلى 6th PBMCs لقياس التدفق الخلوي وامزج 5 × 10 إلى 6th PBMCs مع 10 × 10 إلى 6th 100 خلية 221-mIL-21 مشعة بجاما في لوحة خاصة من 6 آبار. أضف 30 ملليلترا من وسائط R-10 المكملة بإنترلوكين -2 بشري وإنترلوكين -15 بشري إلى نفس اللوحة المكونة من 6 آبار واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، مع استبدال الوسائط كل 3 إلى 4 أيام.
أثناء الحضانة ، قم بتسجيل إجمالي القاتل الطبيعي للدم المحيطي ، أو PBNK ، وصلاحية رقم الخلية وإجراء قياس التدفق الخلوي كل 3 إلى 4 أيام لحساب معدل توسع الخلايا القاتلة الطبيعية. أضف 1.8 × 10 إلى الخلايا التائية السادسة 293 في 11 ملليلتر من وسائط D-10 لكل لوحة معالجة 100 ملم واحتضان خلايا 293T عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في أنبوب سعة 1.70 ملليلتر ، امزج 470 ميكرولترا من وسائط المصل المختزلة مع 30 ميكرولترا من كاشف النقل.
في أنبوب منفصل سعة 1.70 ملليلتر ، أضف 2.5 ميكروغرام من بلازميد pRDF ، و 3.75 ميكروغرام من بلازميد Pegpam3 ، و 2.5 ميكروغرام من بناء CAR في ناقل SFG في وسائط المصل المختزلة لجعل الحجم النهائي 500 ميكرولتر. امزج محتويات الأنبوب مع الأنبوب الذي حجمه 1.70 ملليلتر والذي تم تحضيره مسبقا بطريقة القطرة. بعد 15 دقيقة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، أضف 1 ملليلتر من الخليط من الأنبوب إلى لوحة الخلية 293T بطريقة قطرة ووضع اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 إلى 72 ساعة.
تمييع بروتين retronectin مع PBS إلى تركيز نهائي من 50 إلى 100 ميكروغرام لكل ملليلتر. أضف 500 ميكرولتر من الريترونيكتين المخفف إلى كل بئر من صفيحة غير معالجة من 24 بئرا. ثم أغلق اللوحة باستخدام البارافيلم واحتضن اللوحة عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للوحة retronectin عند 2،103G لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية. بعد سد كل بئر من لوحة 24 بئر مع 1 ملليلتر من وسط R-10 ، احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. قم بتصفية خلايا 293T التي تم نقلها سابقا باستخدام مرشح 0.45 ميكرون لجمع طاف الفيروس القهقري.
القسمة 2 ملليلتر من طاف الفيروس القهقري المصفى في كل بئر من لوحة retronectin 24 بئر. أجهزة الطرد المركزي لوحة 24 بئر retronectin في 2 ، 103G لمدة ساعتين في جهاز طرد مركزي قبل تسخينها عند 32 درجة مئوية. أثناء الطرد المركزي للألواح ، اجمع خلايا PBNK الموسعة من اليوم 0 وعد الخلايا باستخدام Trypan Blue.
تمييع خلايا PBNK الموسعة مع وسائط R-10 المكملة مع interleukin-2 و interleukin-15 إلى تركيز 2.5 × 10 إلى 5 إلى 5 × 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر. بعد الطرد المركزي للوحة retronectin 24 بئر ، استنشاق جزئيا طاف الفيروس القهقري من كل بئر. ثم أضف 2 ملليلتر من خلايا PBNK الموسعة المخففة إلى كل بئر.
قم بالطرد المركزي للصفيحة عند 600 جم لمدة 10 دقائق عند 32 درجة مئوية قبل احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 إلى 72 ساعة. انقل الخلايا من لوحة 24 بئرا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر إلى جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 400 جرام لمدة 5 دقائق. بعد إعادة تعليق الحبيبات ب 1 ملليلتر من وسائط R-10 ، انقل الخلايا المعاد تعليقها إلى لوحة خاصة ذات 6 آبار تحتوي على 30 ملليلتر من وسائط R-10 المكملة ب interleukin-2 و interleukin-15.
احتضان الصفيحة الخاصة المكونة من 6 آبار عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بوسائط منعشة واحسب معدل تمدد الخلايا القاتلة الطبيعية كل 3 إلى 4 أيام. تبين أن خلايا PBNK التي توسعت بمقدار 221-mIL-21 تتوسع تقريبا 5 × 10 إلى الطيات الرابعة. وتم الحفاظ على نقاء الخلايا القاتلة الطبيعية عند حوالي 85٪ طوال فترة التوسع التي استمرت 21 يوما.
قبل التوسع ، تم فحص متانة نظام التمدد 221-mIL-21 عن طريق تلطيخ PBMCs لمضادات CD56 ومكافحة CD3 ، والتي أظهرت نقاء خلية بنسبة 7.09٪ للخلايا القاتلة الطبيعية ونسبة عالية من الخلايا التائية. في اليوم 4 من PBMCs و 221-mIL-21 coculture ، تم فحص نقاء NK قبل نقل CAR-NK. أظهرت خلايا CAR-NK الملطخة بمضادات CD56 ومضادات CD3 ومكافحة IgG البشرية عددا كبيرا من الخلايا القاتلة الطبيعية في اليوم 7 ولوحظ كفاءة نقل CAR عالية تبلغ حوالي 70٪.
في اليوم 18 ، تم فحص تعبير CAR في مجموعات فرعية مختلفة باستخدام قياس التدفق الخلوي. بعد توسع الخلايا القاتلة الطبيعية ، يمكن استخدام الخلايا للمقايسات الوظيفية في المختبر أو للتجارب داخل الجسم الحي. يمكن للباحث استخدام هذا البروتوكول لتوسيع NK و CAR-NK للمرضى الذين يعانون من نقص NK الوظيفي وكذلك الأنواع الأخرى ، مثل الكلب.
