فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور كارل يونيو (جامعة بنسلفانيا) لمساعدة توليد وتوفير استنساخ AAPC رقم 4 والدكتور بيري هاكيت (جامعة مينيسوتا) للحصول على مساعدة مع نظام SB. منحة الدعم: منح مركز السرطان الأساسية (CA16672)؛ RO1 (CA124782، CA120956، CA141303)؛ R33 (CA116127)؛ P01 (CA148600)؛ SPORE (CA136411)، وألبرت J وارد المؤسسة؛ بوروز ويلكوم الصندوق؛ Gillson Longenbaugh المؤسسة؛ الوقاية من السرطان ومعهد بحوث تكساس؛ CLL مؤسسة أبحاث العالمية؛ زارة الدفاع؛ العقارية من Noelan L. Bibler؛ هاري T. Mangurian، الابن، صندوق لعلاج مناعي اللوكيميا؛ معهد علاج السرطان شخصية؛ اللوكيميا سرطان الغدد الليمفاوية والمجتمع؛ الغدد اللمفاوية مؤسسة البحوث؛ MDACC شقيقة مؤسسة شبكة الصندوق؛ ميلر مؤسسة، والسيد هيرب سيمونز، والسيد والسيدة جو H. الموازين، والسيد توماس سكوت، المؤسسة الوطنية لأبحاث السرطان، أمراض الأطفال مؤسسة أبحاث السرطان؛ Assistanc الإنتاجه لالعلاجات الخلوية (PACT)؛ وليام لورانس ومؤسسة هيوز بلانش للطفولة.

<html> أو قبل يوم 0 1. عزل خلايا وحيدات النوى (MNC) من PB وUCB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع PB مع حجم مساو، وUCB مع أربعة مجلدات من PBS-EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدم ببطء طبقة المخفف (25 مل) على Ficoll (12 مل) في أنبوب الطرد المركزي 50 مل (ق) وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 30 - 40 دقيقة (بدون فرامل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع ونقل جزء الخلية وحيدات النوى (واجهة) باستخدام ماصة نقل إلى أنبوب جديد 50 مل الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرح وحدة التخزين إلى 50 مل PBS-EDTA مع وأجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف، بلطف إعادة تعليق بيليه الخلية (الخلايا) في 50 مل من وسائل الإعلام الثقافة كاملة (CCM)، وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف واعادة تعليق الكريات تجمع الخلايا في CCM وتنفيذ عدد خلايا باستخدام أسلوب الاستبعاد التريبان الأزرق (برنامج Cellometer PBMC،). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن الآن أن تستخدم لMNC الصعق الكهربائي (Nucleofection) أو cryopreserved لاستخدامها في المستقبل. </li></ol>عنوان &quot;2&gt;. خلايا T إعداد لالصعق الكهربائي على يوم 0 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا باستخدام MNC cryopreserved، ذوبان الجليد بسرعة كافية لخلايا الصعق الكهربائي على نطاق كامل (2 × 10 8 مضيفا ~ 20٪ لتصل إلى فقدان الخلايا خلال الطرد المركزي و 2 حضانة ساعة) في 37 ° C حمام مائي. إذا كنت تستخدم طازجة معزولة MNC انتقل إلى الخطوة 2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف اعادة تعليق ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي بحجم مناسب (ق) الواردة قبل تحسنت كاملة RPMI ثقافة خالية من الفينول وسائل الإعلام (PF-RPMI) وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 10 دقيقة (لا فرامل)، الرشفة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق MNC في PF-RPMI، تنفيذ عدد خلايا (Cellometer) ونقل الخلايا إلى خلايا سفينة الثقافة بحجم مناسب (ق) عند تركيز من الخلايا 6 10 / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في 37 مرطب ° C / 5٪ CO 2 حاضنة لمدة 2 ساعة 30 دقيقة ±. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إلى أنبوب الطرد المركزي MNC العقيمة (ق)، وتدور في 200 XG لمدة 5 دقائق (بلا فرامل)، نضح طاف ص وبلطفتعليق البريد والجمع بين بيليه الخلية (الخلايا) في PF-RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ عدد خلايا (Cellometer) وحساب حجم الخلية المطلوبة التعليق (2 × 10 8 MNC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل حجم المحسوبة إلى 50 مل العقيمة أنبوب الطرد المركزي وتدور في 200 XG لمدة 10 دقيقة (لا فرامل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف بحيث لا يبقى سائل الإعلام المتبقية وبلطف من خلال استغلال جانب من أنبوب إعادة تعليق. </li></ol> 3. الصعق الكهربائي (Nucleofection) من MNC (كامل عملية مقياس باستخدام 10 Cuvettes) على يوم 0 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل احتضان معقمة جيدا 12-وحة مع 10 آبار تحتوي على 4 مل من RPMI-PF دافئة في 37 مرطب ° C / 5٪ CO 2 الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقبل إعداد الحارة الحل Nucleofector Lonza الإنسان T عدة خلايا (في تشكيل تعليمات الشركة الصانعة، <a href="http://www.lonza.com" target="_blank">www.lonza.com</a> ) لدرجة الحرارة المحيطة في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية (BSC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل Nucleofector / DNA مزيج من الدين سيد100 غ ميكرولتر من حل Nucleofector تستكمل، 15 ميكروغرام من ينقول (DNA البلازميد supercoiled تسمى CD19RCD28/pSBSO) و 5 ميكروغرام من transposase (DNA البلازميد supercoiled تسمى pCMV-SB11) في رد فعل / كوفيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفريق بيليه الخلية (من الخطوة 2.8) من خلال استغلال بلطف إلى جانب أنبوب الطرد المركزي والرئيسي في مزيج Nucleofection حل / DNA (النهائي تركيز الخلية: 2 × 10 7 cells/100 ميكرولتر) إعادة تعليق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 100 ميكرولتر بعناية لتعليق الخلية (من الخطوة 3.4) لكل من عشرة (10) cuvettes Nucleofection Lonza، والحرص على تجنب الفقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على كوفيت مرة واحدة، وelectroporate باستخدام برنامج U-014 (للخلايا T unstimulated). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ونقل cuvettes لوحة 12-جيدا (الخطوة 3.1) إلى BSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا electroporated من كل كوفيت باستخدام نقل معلومات سرية غرامة Amaxa ماصة، وذلك بإضافة ~ 500 ميكرولتر من ثقافة المتوسط ​​قبل تحسنت من المقابلة بشكل جيد (12-أعدت بشكل جيد في سانت لوحةف 3.1) والعودة إلى لوحة بحجم 37 مرطب ° C / 5٪ CO 2 حاضنة لمدة 2 ساعة 30 دقيقة ±. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ساعة 2-الحضانة، والحصاد ونقل الخلايا من جميع الآبار إلى أنبوب الطرد المركزي العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 140 x ج لمدة 8 دقائق، ودرجة الحرارة المحيطة، والفرامل لا نضح وتجاهل طاف بحيث لا يغطي المتوسطة المتبقية بيليه الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفريق بيليه الخلية بالنقر برفق على جانب أنبوب الطرد المركزي وبلطف في CCM إعادة تعليق لتحقيق تعليق خلية واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء عدد خلايا وضبط تركيز الخلية إلى الخلايا 6 10 / مل في CCM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل التعليق الخلية إلى خلية قارورة الثقافة (ق) ووضعت في الحاضنة بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخطوات العملية تكررت 2،1 حتي 3،8 من أجل السيطرة: EGFP-بالنقل الخلايا (5 × 10 6 خلية / كوفيت مع 5 ميكروغرام Amaxa تحكم EGFP supercoiled البلازميد، pmaxGFP). </li></ol> يوم 1 من 1 ش واللاحقةالتحفيز دورات 4. تحليل التعبير CAR بواسطة قياس التدفق الخلوي في اليوم 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا electroporated وإجراء تعداد الخلايا باستخدام أسلوب الاستبعاد التريبان الأزرق (عدادة الكريات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار خلايا (1 إلى 2 × 10 6) مع الأجسام المضادة المحددة لCD4، CD3، CD8، ومفتش Fcγ الإنسان (كما قياس التعبير CAR). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الخلايا Calibur FACS وتحليل البيانات باستخدام برنامج FCS سريع لحساب تعبير عن CAR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب الخلايا في الثقافة + CAR بواسطة الصيغة: (عدد خلايا قابلة للحياة المجموع) × (CAR٪ + الخلايا) = عدد الخلايا + CAR </li></ol></li></ol> 5. إعداد AAPC (استنساخ # 4) في يوم 1. وقد استمدت AAPC (استنساخ # 4) من خلايا K562 (الخط الأبوية تم الحصول عليها من أمريكا نوع كوكتيل الثقافة) للمشاركة في التعبير عن جزيء T المرجوة المشارك تنشيطية الخليوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد في قسامة من المجمدة AAPC جراى 100 المشع في 37 °؛ C ماء الحمام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل مرتين الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 400 x ج، 10 دقيقة في CCM وتحسب باستخدام Cellometer (التريبان الأزرق الاستبعاد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد AAPC قابلة للحياة اللازمة لتحفيز: (عدد الخلايا + CAR) × 2 = عدد AAPC المشع المطلوب </li></ol> 6. AAPC بوساطة حفز خلايا T + CAR في يوم 1 بداية من 1 ش ودورات تحفيز اللاحقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط الخلايا electroporated (التعبير عن CAR) وγ-المشع AAPC (استنساخ # 4) في وعاء معقم في نسبة 1:2 (CAR + الخلية: AAPC قابلة للحياة) في CCM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاحظة يتم ضبط نسبة AAPC للتعبير عن سيارة على أساس التدفق الخلوي في اليوم التالي الصعق الكهربائي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة IL-21 (30 نانوغرام / مل) إلى تعليق خلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة في T-75 سم 2 قارورة (ق) و / أو أكياس فيو ثقافة الحياة عند تركيز من الخلايا 6 10 / مل والعودة إلى incubatأو. </li></ol> 3 أيام، 5 7. استمرار ثقافة CAR + T خلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء تغيير نصف وسائل الإعلام، تجديد IL-21، والحفاظ على خلايا T في تركيز الخلايا 6 10 / مل. </li></ol> يوم 7 8. نهاية أول دورة تحفيز AAPC بوساطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الحصاد، عد وصمة عار لCD4، CD3، CD8، وFcγ (CAR)، وانتقل إلى الخطوة 10.1. </li></ol> 9. نضوب خلايا CD56 + (عادة ما بين 7 و 14 أيام بعد الصعق الكهربائي) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء استنزاف CD56 باستخدام الخرز ممغطس إذا CD56 + CD3 الخلايا الليمفاوية NEG ≥ 10٪. </li></ol> دورات التحفيز # 2، # 3، # 4 و 8 أيام الموافق → 14، لمدة 15 يوما → 21، أيام 22 و 28 → 10. عودي إضافة AAPC لنشر خلايا T إلى أرقام سريريا ذاتيا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار stimulatioن عملية (4 مرات) كما هو موضح في الخطوات 4،3-8،1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة IL-2 (50U/ml) إلى الثقافات التي تبدأ في أيام 7 و 14 و 21، وبعد ذلك عند كل تغيير وسائل الإعلام (ثلاث مرات في الأسبوع، وفقا لجدول من الاثنين إلى الأربعاء إلى الجمعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryopreserve (الأرشيف) خلايا T الزائد حسب الحاجة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا T تجميد الفريزر باستخدام معدل للرقابة. </li></ol></li></ol> اليوم 28 11. نهاية آخر دورة تحفيز AAPC بوساطة: خلايا T الحصاد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryopreserve الخلايا T للاختبار وإصدار التسريب. </li></ol>

<ol>
	<li>Jena, B., Dotti, G., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redirecting+T-cell+specificity+by+introducing+a+tumor-specific+chimeric+antigen+receptor.">Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor.</a> Blood. 116, 1035-1044 (2010).</li><li>Ertl, H. C., Zaia, J., Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+clinical+application+of+chimeric+antigen+receptor+T+cells:+observations+from+a+recombinant+DNA+Advisory+Committee+Symposium+held.">Considerations for the clinical application of chimeric antigen receptor T cells: observations from a recombinant DNA Advisory Committee Symposium held.</a> Cancer Res. 71, 3175-3181 (2010).</li><li>Kohn, D. B., Dotti, G., Brentjens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARs+on+track+in+the+clinic.">CARs on track in the clinic.</a> Mol. Ther. 19, 432-438 (2011).</li><li>Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sleeping+Beauty+transposon+system:+a+non-viral+vector+for+gene+therapy.">The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy.</a> Hum. Mol Genet. 20, R14-R20 (2011).</li><li>Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon+and+transposase+system+for+human+application.">A transposon and transposase system for human application.</a> Mol. Ther. 18, 674-683 (2010).</li><li>Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+Sleeping+Beauty+transposition+into+cellular+therapies:+victories+and+challenges.">Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges.</a> Bioessays. 32, 756-767 (2010).</li><li>Kebriaei, P., Huls, H., Bipulendu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusing+CD19-directed+T+cells+to+augment+disease+control+in+patients+undergoing+autologous+hematopoietic+stem-cell+transplantation+for+advanced+B-lymphoid+malignancies.">Infusing CD19-directed T cells to augment disease control in patients undergoing autologous hematopoietic stem-cell transplantation for advanced B-lymphoid malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 23 (5), 444-450 (2012).</li><li>Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+beauty+vector+system+moves+toward+human+trials+in+the+United+States.">Sleeping beauty vector system moves toward human trials in the United States.</a> Mol. Ther. 16, 1515-1516 (2008).</li><li>Geurts, A. M., Hackett, C. S., Bell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+prediction+of+insertion-site+preferences+of+transposons+into+chromosomes.">Structure-based prediction of insertion-site preferences of transposons into chromosomes.</a> Nucleic Acids Res. 34, 2803-2811 (2006).</li><li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+reconstruction+of+Sleeping+Beauty,+a+Tc1-like+transposon+from+fish,+and+its+transposition+in+human+cells.">Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells.</a> Cell. 91, 501-510 (1997).</li><li>Izsvak, Z., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+beauty+transposition:+biology+and+applications+for+molecular+therapy.">Sleeping beauty transposition: biology and applications for molecular therapy.</a> Mol Ther. 9, 147-156 (2004).</li><li>Manuri, P. V., Wilson, M. H., Maiti, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposon/transposase+system+to+generate+CD19-specific+T+cells+for+the+treatment+of+B-lineage+malignancies.">piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 21, 427-437 (2010).</li><li>Singh, H., Figliola, M. J., Dawson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+CD19-specific+T+cells+with+IL-21+signaling+can+improve+adoptive+immunotherapy+of+B-lineage+malignancies.">Reprogramming CD19-specific T cells with IL-21 signaling can improve adoptive immunotherapy of B-lineage malignancies.</a> Cancer Res. 71, 3516-3527 (2011).</li><li>Kowolik, C. M., Topp, M. S., Gonzalez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+provided+through+a+CD19-specific+chimeric+antigen+receptor+enhances+in+vivo+persistence+and+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+T+cells.">CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells.</a> Cancer Res. 66, 10995-11004 (2006).</li><li>Jin, Z., Maiti, S., Huls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+SB100X+improves+the+genetic+modification+of+T+cells+to+express+a+chimeric+antigen+receptor.">The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor.</a> Gene Ther. 18, 849-856 (2011).</li><li>Davies, J. K., Singh, H., Huls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+CD19+redirection+and+alloanergization+to+generate+tumor-specific+human+T+cells+for+allogeneic+cell+therapy+of+B-cell+malignancies.">Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies.</a> Cancer Res. 70, 3915-3924 (2010).</li><li>Kebriaei, P., Kelly, S. S., Manuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARs:+driving+T-cell+specificity+to+enhance+anti-tumor+immunity.">CARs: driving T-cell specificity to enhance anti-tumor immunity.</a> Front. Biosci. (Schol. Ed). 4, 520-531 (2012).</li><li>Singh, H., Manuri, P. R., Olivares, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redirecting+specificity+of+T-cell+populations+for+CD19+using+the+Sleeping+Beauty+system.">Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system.</a> Cancer Res. 68, 2961-2971 (2008).</li><li>Nakazawa, Y., Huye, L. E., Salsman, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac-mediated+cancer+immunotherapy+using+EBV-specific+cytotoxic+T-cells+expressing+HER2-specific+chimeric+antigen+receptor.">PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor.</a> Mol. Ther. 19, 2133-2143 (2011).</li><li>Huang, G., Yu, L., Cooper, L. J., Hollomon, M., Huls, H., Kleinerman, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+T+cells+targeting+interleukin-11+receptor+alpha-chain+kill+human+osteosarcoma+cells+and+induce+the+regression+of+established+osteosarcoma+lung+metastases.">Genetically modified T cells targeting interleukin-11 receptor alpha-chain kill human osteosarcoma cells and induce the regression of established osteosarcoma lung metastases.</a> Cancer Res. 72, 271-281 (2012).</li><li>Huang, X., Guo, H., Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+Beauty+transposon-mediated+engineering+of+human+primary+T+cells+for+therapy+of+CD19++lymphoid+malignancies.">Sleeping Beauty transposon-mediated engineering of human primary T cells for therapy of CD19+ lymphoid malignancies.</a> Mol. Ther. 16, 580-589 (2008).</li><li>Huang, X., Wilber, A., McIvor, R. S., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transposons+for+modification+of+human+primary+T+lymphocytes.">DNA transposons for modification of human primary T lymphocytes.</a> Methods Mol. Biol. 506, 115-126 (2009).</li><li>Hackett, P. B., Aronovich, E. L., Hunter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+Sleeping+Beauty+transposon-mediated+gene+transfer+in+preclinical+animal+studies.">Efficacy and safety of Sleeping Beauty transposon-mediated gene transfer in preclinical animal studies.</a> Curr. Gene Ther. 11, 341-349 (2011).</li><li>Suhoski, M. M., Golovina, T. N., Aqui, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+artificial+antigen-presenting+cells+to+express+a+diverse+array+of+co-stimulatory+molecules.">Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules.</a> Mol. Ther. 15, 981-988 (2007).</li><li>Numbenjapon, T., Serrano, L. M., Singh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+artificial+antigen-presenting+cell+to+propagate+cytolytic+CD19-specific+T+cells.">Characterization of an artificial antigen-presenting cell to propagate cytolytic CD19-specific T cells.</a> Leukemia. 20, 1889-1892 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ينقول ونظم transposase، مثل من piggyBac 12،19 وSB 18،20-22، غير أن النهج للفيروسات العلاج الجيني التي هي بديل لالفيروسي بوساطة تنبيغ من CAR الصف السريرية + الخلايا التائية. تم اختيار SB كما نقل الجين نظام يعتمد على قدرته على العلاج الجيني البشري 1،6،23. قمنا بتطوير التكنولوجيات المزدوجة للتبديل SB (لإدخال CAR) وإضافة العودية من γ-المشع AAPC (لاسترداد خلايا T المعدلة وراثيا معربا عن ثابت سيارة) لتكون بمثابة منصة التقنيات في صناعة الخلايا T-TAA محددة في الامتثال مع المركب للمرحلة I / II التجارب (الشكل 4). بعد 28 يوما (أربعة دورات التحفيز لمدة 7 أيام) من الثقافة المشتركة على γ-المشع AAPC، ونحن عادة ما تكون قادرة على توليد ما لا يقل عن 10 10 ~ خلايا T المعدلة وراثيا مناسبة للتطبيقات الإنسان. حسب الحاجة، ويمكن القيام دورات التحفيز إضافية رس توليد أعداد أكبر من الخلايا T المعدلة وراثيا. وعلاوة على ذلك، إذا كانت هناك حاجة أقل CAR + T الخلايا، يمكن تحجيم النهج المتبع في الصعق الكهربائي وانتشار توظيف عدد أقل من عودة cuvettes والمضي قدما مجرد مجموعة فرعية من الخلايا T وتوسعت عدديا لجولات لاحقة من انتشار على AAPC في بداية كل دورة التحفيز. electroporated غالبية خلايا T ونشر حصاد للتسريب التعبير عن ثابت جمهورية أفريقيا الوسطى. آل إليه CD4 + + CD8 الخلايا وT معربا عن جيلنا الثانية 2 CAR تشمل خلايا الذاكرة مع النمط الظاهري / ساذجة وسيعرض ثلاث بصمات إعادة توجيه خصوصية. أولا، T الخلايا المعدلة وراثيا على وجه التحديد الأهداف ليز + CD19، وثانيا، إنتاج الإنترفيرون γ استجابة لمحفز الخلايا CD19 + وثالثا، تتكاثر ردا على CD19 + الخلايا المغذية، كل بطريقة CAR-تعتمد 13،18. لدينا نهج لintegrيمكن القيام بها يأكلون التحوير CAR عن طريق التحويل الكهربائي من البلازميدات DNA غير الفيروسية من النظام SB في الخلايا T هادئة الأولية المستمدة من PB وUCB. عدلت وراثيا وغيرها ونحن K562 الخلايا لتكون بمثابة AAPC للنشر الأرقام بكفاءة سريريا ذاتيا من الخلايا T للتسريب 24،25. لقد تم AAPC والأنسجة البيئة ثقافة (مثل إضافة IL-21) قد تم تعديلها لتوليد المريض والجهات المانحة المستمدة CD19 خلايا T محددة للتسريب بعد زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (الجدول 1) 13،18. نحن يمكن ان تنتج خلايا T + CAR من PB حصل ببساطة عن طريق بزل الوريد الذي يتجنب تكلفة، وعدم الراحة، والحصول على إزعاج MNC من PB بواسطة فصادة. القدرة على استخلاص عدد كبير من الخلايا T + CAR من أعداد صغيرة من MNC جذابة بشكل خاص لغرس الخلايا T بعد زرع خيفي UCB. صغر حجم وعدم الكشف عن الجهة المانحة يحول دون إعادة حديثي الولادة-الوصول إلى هذا الشخص في وقت لاحق نقطة وأرقام محدود فقط من الشركات متعددة الجنسيات المقطوع تتوفر المواد اللازمة لبدء تصنيع الخلايا T لتجنب التداخل مع تكون الدم. مزيد من التقدم في عملية التصنيع يتم تنفيذها حاليا لتشمل الصعق الكهربائي و جهاز إنتاجية عالية إلى جانب وجود مفاعل حيوي WAVE مغلقة تماما للحد من التعامل معها. في مجموعها، وSB وAAPC جذابة لتوليد منصات CD19 محددة CAR + T الخلايا التي يمكن تكييفها لتوليد أعداد كبيرة من الخلايا T المعدلة وراثيا التي يمكن التعرف البديلة سطح الخلية TAAs في الامتثال المركب.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الكواشف </td><td> بائع </td><td> كتالوج رقم </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الكواشف </td></tr><tr><td> وإذ تعرب عن GFP البلازميد الحمض النووي (pmaxGFP) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 (طقم) </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> سيجما </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS PBS-EDTA </td><td> Miltenyi بيوتيك </td><td> 70026 </td><td></td></tr><tr><td> HyQ RPMI-1640 </td><td> الحرارية العلمية </td><td> SH30096.01 </td><td></td></tr><tr><td> الفينول مجاني RPMI-1640 </td><td> الحرارية العلمية </td><td> SH30605.01 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone مصل بقري جنيني </td><td> الحرارية العلمية </td><td> SH3007003HI </td><td></td></tr><tr><td> GlutaMAX(100X) </td><td> Gibco </td><td> 3505-061 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque </td><td> GE للرعاية الصحية العلوم البيولوجية </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> الإنسان IL-21 المؤتلف </td><td> PeproTech </td><td> AF-200-21 </td><td></td></tr><tr><td> الإنسان IL-2 المؤتلف (Proleukin) </td><td> نوفارتس </td><td> NDC 65483-116-07 </td><td></td></tr><tr><td> الإنسان كيت خلية T (محلول Nucleofector) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS CD56 الكاشف </td><td> Miltenyi </td><td> 70206 </td><td></td></tr><tr><td> FITC، مترافق إلى الماوس ماب محددة لCD3 الإنسان </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 349201 </td><td></td></tr><tr><td> APC-مترافق لماب محددة الماوس لCD4 الإنسان </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 340443 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5، مترافقلماب محددة CD8 الإنسان الماوس لل </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 341051 </td><td></td></tr><tr><td> PE-F لمترافق (&#39;AB) 2 جزء من الأجسام المضادة البشرية الماعز محددة لFcγ </td><td> إينفيتروجن </td><td> H10104 </td><td></td></tr><tr><td> أزيد الصوديوم </td><td> سيجما </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> المستهلكات </td></tr><tr><td> 12-وحة جيدا </td><td> كورنينج </td><td> 3513 </td><td></td></tr><tr><td> T-75 سم 2 قارورة </td><td> كورنينج </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> ثقافة الحقائب </td><td> VUE الحياة </td><td> 290C؛ 750C </td><td></td></tr><tr><td> 50 مل أنبوب الطرد المركزي </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 352098 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><sترونج&gt; معدات </td></tr><tr><td> Amaxa Nuceleofector II </td><td> Lonza </td><td> AAB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer </td><td> العلوم البيولوجية Nexcelom </td><td> Cellometer الرؤية </td><td></td></tr><tr><td> الكتب التي طرد مركزي أسطورة RT </td><td> الكتب التي </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td> تسيطر معدل الفريزر </td><td> المسوي </td><td> Kryo 750 </td><td></td></tr><tr><td> Irradiator </td><td> CIS الحيوي الدولية </td><td> IBL-437 C # 09433 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="4"> التعبير عن جزيئات (الذاتية وعرض) </td></tr><tr><td> خلية الخط </td> &lt;TD&gt; الاسم الشائع </td><td> خلية نوع </td><td> أعربت عن جزيئات </td></tr><tr><td> CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 </td><td> استنساخ 4 </td><td> K562 </td><td> CD86، CD64، CD137L، CD19، شارك في GFP غشاء ملزمة أعرب مع IL-15 </td></tr></tbody></table> الإعلام الثقافة كاملة (CCM) (C ° تخزينها في 4 لتصل إلى 30 يوما) HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640 10٪ FBS 1٪ GlutaMAX تدفق العازلة الخلوي (المخزنة في C ° 4 لمدة تصل إلى 30 يوما) PBS 2٪ FBS 0.1٪ أزيد الصوديوم </td></tr></tbody></table>

clinical application of sleeping beauty and artificial antigen presenting cells to genetically modify t cells from peripheral and umbilical cord blood

يمكن تحسين فعالية الخلايا T-السريرية الصف من خلال الجمع بين العلاج الجيني مع العلاج المناعي لهندسة منتج بيولوجي مع إمكانية الاعتراف (ط) متفوقة من الورم المستضدات المرتبطة (TAAs)، (الثاني) بعد استمرار التسريب، (الثالث) إمكانية الهجرة إلى مواقع الأورام، و (رابعا) القدرة على إعادة تدوير وظائف المستجيب داخل الورم المكروية. وقد استخدمت معظم النهج للتلاعب الجيني للخلايا T هندسيا للتطبيق الارتجاعي الإنسان والفيروسة البطيئة للتعبير مستقرة. 1-3 CAR. هذا النهج، على الرغم متوافقة مع ممارسات التصنيع الجيدة الحالية (GMP)، ويمكن أن تكون مكلفة لأنها تعتمد على تصنيع وإطلاق السريرية الصف فيروس المؤتلف من عدد محدود من مرافق الإنتاج. نقل الكهربائية من البلازميدات nonviral هو بديل جذاب لتنبيغ منذ الأنواع يمكن أن تنتج DNA إلى الصف السريرية في حوالي 1/10 ال تكلفة recombinالنمل GMP الصف الفيروس. لتحسين كفاءة التكامل أننا تكييفها الجميلة النائمة (SB) ينقول وtransposase لتطبيق 4-8 الإنسان. نظامنا يستخدم SB البلازميدات DNA اللذين تتكون من ينقول الترميز لجين ذات الاهتمام (مثل الجيل الثانية 2 CD19 محددة التحوير CAR، CD19RCD28 المعينة) وtransposase (مثل SB11) الذي يدرج في التحوير ثنائي النوكليوتيد TA يكرر 9-11 . لإنشاء أرقام سريريا ذاتيا من الخلايا T المعدلة وراثيا التي نستخدمها K562 المستمدة من الخلايا مستضد تقديم الاصطناعي (AAPC) (استنساخ # 4) تعديل للتعبير عن TAA (مثل CD19) وكذلك جزيئات الخلية costimulatory T CD86، CD137L، وهو غشاء محدد إصدار انترلوكين (IL) -15 (الببتيد تنصهر المنطقة لتعديل التيسير IgG4) وCD64 (FC-γ مستقبلات 1) لتحميل الاجسام المضادة (ماب) 12. في هذا التقرير، إلا أننا شرح الإجراءات التي يمكن القيام بها في compliaNCE مع المركب لتوليد CD19 محددة CAR + T الخلايا البشرية المناسبة للتطبيق. وقد تحقق ذلك من قبل متزامن الكهربائية نقل البلازميدات DNA اثنين، ينقول SB (CD19RCD28) وtransposase SB (SB11)، يليه استرجاع integrants مستقرة من قبل كل الإضافات-7-اليوم (دورة التحفيز) من γ-المشع AAPC (استنساخ # 4) في حضور IL-2 للذوبان الإنسان المؤتلف و 13 IL-21. وتجري عادة 4 دورات (28 يوما للثقافة مستمر) لإنشاء أرقام سريريا-T جاذبية من الخلايا التي تعبر عن ثابت جمهورية أفريقيا الوسطى. ويمكن تطبيق هذه المنهجية لتصنيع الخلايا السريرية الصف T-CD19 محددة لخلايا T المستمدة من الدم المحيطي (PB) أو دم الحبل السري (UCB). وعلاوة على ذلك، يمكن تسخير هذا النهج لتوليد خلايا T لأنواع الأورام المختلفة من إقران خصوصية CAR المقدمة مع التعبير عن TAA، معترف بها من قبل CAR، على AAPC.

نفيد يمكن استخدامها الكهربائية نقل البلازميدات الحمض النووي وانتشار الخلايا T-γ على المشع AAPC لتوليد أرقام سريريا-T جاذبية من الخلايا المشتقة من PB وUCB للتطبيقات الإنسان. هذه الخلايا المعدلة وراثيا T إبداء CAR عرض تعترف TAA CD19، مستقلة عن مجمع التوافق النسيجي الرئيسي. والبلازميدات DNA SB-المشتقة للتعبير عن ينقول (ط)، سيارة الجيل 2 الثانية (CD19RCD28) أن إشارات من خلال CD28-ε CD3 و14، و (الثاني) تم transposase، SB11 15، التي سبق وصفها 13، 16،17 . تم إنتاج البلازميدات المستخدمة في الدراسة الحالية تجاريا من قبل مرفق ايزمان Biomanufacturing السريرية (ماديسون، WI). وAAPC (استنساخ # 4)، والمستمدة من الخلايا K562 (خط الوالدين الحصول عليها من أمريكا نوع كوكتيل الثقافة)، وشارك في التعبير عن خلية T المرجوة جزيئات شارك في تنشيطية (كل جزيء في عرض 3 90٪ على سطح الخلية من AAPC)،كما هو موضح سابقا 12. هنا نعرض التي يمكن أن تتولد خلايا CD19 محددة من الخلايا T وحيدات النوى (MNC) المستمدة من PB أو باستخدام UCB SB تبديل لتقديم CAR تليها إضافة AAPC لتوسيع الخلايا T عدديا بطريقة CAR التي تعتمد على (الشكلان 1 ، 4) 13،18. وelectroporated عشرة cuvettes (2X10 7 MNC / كوفيت) لكل مستلم باستخدام 15 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد (CD19RCD28/pSBSO) الترميز لينقول (CAR) و 5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد (pCMV-SB11) الترميز لtransposase (SB11). ويمكن تخفيض عدد cuvettes إذا MNC تحد أو تقليص للعمل المختبر. ويعرف اليوم من الصعق الكهربائي و&quot;0 يوم&quot; دورة تحفيز # 1. كما ضوابط لظروف التدفق الخلوي والثقافة، وخلايا T هي ذاتي electroporated وهمية (DNA البلازميد دون) وتوسعت عدديا على γ-المشع AAPC (استنساخ # 4) أنه تم محملة مسبقا مع OKT3 إلى الارتباط عبور CD3 للحفاظ على الخلية T الانتشار. نحن صتقييم كفاءة outinely electrotransfer وبقاء خلايا T في اليوم التالي الصعق الكهربائي (الشكل 2B). التعبير عن EGFP من DNA البلازميد التحكم (المعين pmaxGFP) وCAR في هذه المرحلة الأولية الوقت يعكس التعبير عن البروتين المتكامل والبلازميد episomal. عادة، بعد يوم من الصعق الكهربائي و نقيس EGFP التعبير في التعبير ~ 60٪ وبنسبة 40٪ في CAR ~ (الشكل 2A) مع بقاء الخلية T بين 40-50٪. إضافات متكررة من γ-المشع AAPC في حضور IL-2 للذوبان الإنسان المؤتلف وIL 21-T استرداد الخلايا معربا عن ثابت CAR (CD19RCD28). ونضبت CD3 + CD56 NEG خلايا NK من ثقافة استخدام الخرز ممغطس CD56 محددة إذا كانت نسبة هذه الخلايا NK هو ≥ 10٪ وخاصة إذا كانت نسبة CAR أعرب عن خلايا T منخفضة. هذا النزف يمنع فرط السريع لخلايا NK التي يتداخل مع قدرة AAPC للحفاظ على proliferatioن من الخلايا T + CAR. في بعض الأحيان، يجري استنزاف خلايا NK من خلايا T + CAR خلال دورات التحفيز مشاركة اثنين، ولكن هذا يدخل فقدان الخلايا المطلوب بسبب التعبير المشارك للCD56 على بعض الخلايا T + CAR. كانت تزرع الخلايا T في نظام مغلق وظيفيا استعمال الأكياس فيو ثقافة الحياة اليوم 14 الماضية. وعادة cryopreserved مجموعة فرعية من الخلايا T والمعدلة وراثيا ونشر في يوم 14 أو يوم 21 (نهاية دورات تحفيز # # 2 أو 3) الثقافة المشتركة على AAPC لتكون بمثابة مصدر للمواد المحفوظة لتحاليل المستقبل وتكون ل إذابة إذا تحدث مشاكل غير متوقعة في وقت لاحق أثناء عملية التصنيع. ويتم حصاد الخلايا T عادة في أو حول يوم 28 من ثقافة (الشكل 3) التي تعبر عن روتيني&gt; CAR 90٪ وهي&gt; 80٪ قابلة للحياة (الشكل 2C، D). لقد أظهرنا سابقا أنه بعد أربعة أسابيع من الثقافة المشتركة على AAPC المتوسط ​​أضعاف توسيع CD3 + T الخلايا هو 19800 11313 ± مع CA<html> R + التعبير كونها 90٪ ± 7.5 13. وهذه الخلايا T cryopreserved والخضوع في عملية الافراج والاختبار التي تبلغ عن سلامة والعلاجية المحتملة للمنتج المصنعة. ويجري اختبار إطلاق امتثالا السريرية التعديلات تحسين المختبرات (CLIA) لإنشاء شهادة التحليل قبل التسريب في المتلقين على التجارب السريرية. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1.jpg" /> الشكل 1. إبراز الخطوات العملية لنشر وelectroporate CAR + T من الخلايا PB وUCB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig1large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . upload/50070/50070fig2highres.jpg &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg &quot;/&gt; الشكل 2. توصيف الخلايا T المعدلة وراثيا من PB. (A) في التعبير عن EGFP يوم 0 دورة التحفيز الأولى لتقييم كفاءة نقل الجينات. التعبير عن CD19 محددة CAR (CD19RCD28) وفقا لتقييم التدفق الخلوي على CD3 +، + CD8 CD4 + الخلايا وT في ساعة حوالي 24 (B) بعد الصعق الكهربائي و(C) 28 يوما بعد المشاركة في الثقافة على AAPC. ولوحظ التعبير مماثلة من الخلايا T CAR مع UCB المشتقة. (D) حركية التعبير CAR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig2large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . <img alt="الشكل 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3.jpg" /> الشكل 3. نشر PB-مشتقة CAR+ T الخلايا. معدل التوسع الرقمية من CD3 + + وCAR خلايا T المستمدة من PB بتكرار الثقافة المشتركة على γ-المشع AAPC في وجود الإنسان المؤتلف للذوبان IL-2 وIL 21-. الأسهم إلى أعلى تشير إلى إضافات من γ-المشع AAPC التي تميز بداية كل دورة التحفيز. UCB المستمدة من الخلايا T + CAR يحمل معدلات مماثلة من التوسع رقمية. <img alt="الشكل 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4.jpg" /> الشكل 4. التخطيطي لعملية التصنيع باستخدام SB ونظم AAPC لتعديل وراثيا ونشر CAR + T تم إنشاؤها الخلايا المشتقة من PB وUCB. CD19 محددة CAR + T الخلايا عن طريق التحويل الكهربائي من SB-DNA supercoiled المستمدة البلازميدات واللاحقة شارك في الثقافة على K562 المستمدة AAPC (استنساخ # 4) في س الوجودو IL-2 المؤتلف للذوبان الإنسان وIL-21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig4large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td width="5"> T الخلية المصدر </td><td width="9"> ينقول * </td><td width="9"> Transposase </td><td width="26"> T الخلية التسريب </td><td width="1"> IRB # </td><td width="1"> NIH-OBA # </td><td width="1"> IND # </td></tr><tr><td> ذاتي (المشتقة من المريض) ** </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> بعد ذاتي زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم </td><td> 2007-0635 </td><td> 0804-922 </td><td> 14193 </td></tr><tr><td> خيفي (المانحة المشتقة) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> بعد خيفي زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم </td><td> 2009-0525 </td><td> 0910-1003 </td><tد&gt; 14577 </td></tr><tr><td> خيفي (المانحة المشتقة) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> بعد خيفي زرع الحبل السري الدم </td><td> 2010-0835 </td><td> 1001-1022 </td><td> 14739 </td></tr></tbody></table> * الجدول 1. التجارب السريرية تحت رعاية ادارة الاغذية والعقاقير في MDACC لبث CD19 محددة CAR نشر خلايا T + على AAPC. يتم تقديم الخلايا T محددة لCD19 التعبير من خلال القسري للSB ينقول الترميز لسيارة الجيل الثاني 2، CD19RCD28 المعينة، أن إشارات من خلال CD28 وCD3 ε. ** الابتدائية الموضحة في المرجع 5.

Watch this Scientific Journal Video about Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood at JoVE

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

وغرست الخلايا T تعبر عن CD19 محددة مستضد خيالية مستقبلات (CAR)، والعلاج الفحص من الأورام الخبيثة الخلايا B-من خلال موقعنا الأول في التجارب البشرية العلاج الجيني. وصفنا التعديل الوراثي للخلايا T باستخدام<em&gt; الجمال النائم</em&gt; (SB) لإدخال نظام CD19 محددة CAR ونشر انتقائي على الخلايا مصمم CD19 + مستضد تقديم الاصطناعي.

السريرية تطبيق<em&gt; الجمال النائم</em&gt; ومستضد تقديم الخلايا الاصطناعية لتعديل وراثيا خلايا T من دم الحبل السري والمحيطية

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

clinical-application-sleeping-beauty-artificial-antigen-presenting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

18.2K Views.  U.T. MD Anderson Cancer Center. وغرست الخلايا T تعبر عن CD19 محددة مستضد خيالية مستقبلات (CAR)، والعلاج الفحص من الأورام الخبيثة الخلايا B-من خلال موقعنا الأول في التجارب البشرية العلاج الجيني. وصفنا التعديل الوراثي للخلايا T باستخدام الجمال النائم (SB) لإدخال نظام CD19 محددة CAR ونشر انتقائي عل...

Video: Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

HLA - الإيج بناء خلايا مولدة الاصطناعي تقديم الكفء لل خارج الحي توسيع CTL الإنسان

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &amp;#947;&amp;#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

التوسع في الدم المحيطي الإنسان خلايا T γδ باستخدام Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

توسيع الخلايا اللمفاوية T السامة للخلايا من دم الحبل السري أن الفيروس المضخم للخلايا الهدف، فيروس ابشتاين بار، واتش

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

مستضد تقديم الاصطناعي تنشيط الخلية بوساطة (AAPC) والتوسع في الخلايا التائية القاتلة الطبيعية

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

عزل مجموعات فرعية B-الخلية السلائف من دم الحبل السري

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

القاتل مستضد تقديم الخلايا الاصطناعي (KaAPC) للكفاءة<em&gt; في المختبر</em&gt; استنفاد خلايا T الإنسان مستضد محددة

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

توليد خلايا T الإنسان مستضد خيفي محددة من الدم المحيطي

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

تطوير التهاب القولون نموذج مدفوعة مستضد لدراسة عرض المستضدات التي كتبها مستضد الخلايا إلى خلايا T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells differentiate to form platelet precursors called megakaryocytes, which terminally differentiate to release platelets from long cytoplasmic processes termed proplatelets. Megakaryocytes are rare cells confined to the bone marrow and are therefore difficult to harvest in sufficient numbers for laboratory use. Efficient production of human megakaryocytes can be achieved in vitro by culturing CD34+ cells under suitable conditions. The protocol detailed here describes isolation of CD34+ cells by magnetic cell sorting from umbilical cord blood samples. The necessary steps to produce highly pure, mature megakaryocytes under serum-free conditions are described. Details of phenotypic analysis of megakaryocyte differentiation and determination of proplatelet formation and platelet production are also provided. Effectors that influence megakaryocyte differentiation and/or proplatelet formation, such as anti-platelet antibodies or thrombopoietin mimetics, can be added to cultured cells to examine biological function.

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

A highly pure population of megakaryocytes can be obtained from cord blood-derived CD34+ cells. A method for CD34+ cell isolation and megakaryocyte differentiation is described here.

Megakaryocyte التمايز وتكوين الصفائح الدموية من الإنسان الحبل CD34 المستمدة من الدم الخلايا+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

جيل من التمييزية مونوكلونل البشرية من خلايا نادرة محددة مستضد ب المتداولة في الدم

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...