Этот протокол может значительно улучшить расширение функциональных, неисчерпывающих, похожих на память NK-клеток ex vivo по сравнению с другими фидерными клетками, основанными на системе расширения. Это более простой метод по сравнению с другими протоколами, использующими фидерные клетки, в которых мы пропускаем этап изоляции NK-клеток до расширения NK-клеток. Этот протокол может обеспечить достаточное количество NK-клеток и CAR-NK для иммунотерапии.
Этот метод обладает высокой воспроизводимостью. Тем не менее, использование свежих, новых исходных материалов и забота о том, чтобы не беспокоить NK-клетки в течение первых нескольких дней расширения, имеет решающее значение. Начните с выявления и секционирования жизнеспособных областей ткани с использованием стерильного хирургического оборудования для получения лимфоцитов.
Затем поместите разрезанные ткани в 30 миллилитров HBSS без кальция или магния и держите ткань на льду до готовности к выделению. Работая внутри шкафа биобезопасности, измельчите ткань на кубики размером менее 0,5 сантиметра стерильными лезвиями бритвы и щипцами. Поместите измельченные кусочки ткани, не более 4 грамм, в тканевые диссоциаторные трубки и добавьте 10 миллилитров коллагеназы IV к кусочкам ткани.
Чтобы тщательно измельчить ткань, обработайте трубки тканевого диссоциатора диссоциатором тканей при температуре 37 градусов Цельсия. После удаления трубок из тканевого диссоциатора тритурируют измельченную ткань через 40-микронный нейлоновый клеточный сетчатый фильтр, используя заднюю часть 5-миллилитрового шприца. Отбросьте крупные непереваренные фрагменты.
Открутите собранный элюент при 400G в течение 5 минут при комнатной температуре и аспирируйте супернатант перед повторным использованием клеточных гранул в 30% покрытом поливинилпирролидоном кремнеземе для удаления жировых клеток. Раскрутите клетки, как описано до повторного использования клеточной гранулы в 9 миллилитрах среды R-10. Чтобы отделить лимфоциты от эритроцитов и полиморфноядерных клеток, аккуратно наложите клеточную суспензию на 4 миллилитра Фиколла или среды разделения лимфоцитов.
Отделите слои центрифугированием при 400G в течение 23 минут при комнатной температуре с выключенным ускорением и торможением. Затем тщательно декантируют верхний средний слой и собирают интерфазу, содержащую инфильтрирующие ткани лимфоциты. Промыть клетки 10 миллилитрами среды и приступить к анализу или первичному природному киллеру, или NK, протоколу расширения клеток.
Промыть мононуклеарные клетки периферической крови, или PBMCs, и 100 гамма-облученных 221-mIL-21 клеток отдельно центрифугированием при 400G в течение 5 минут 10 миллилитрами среды R-10. После центрифугирования сохраните 1 х 10 до 6-го ПБМК для проточной цитометрии и смешайте 5 х 10 к 6-м НБМК с 10 х 10 до 6-го 100 гамма-облученных 221-мИЛ-21 клеток в специальной 6-луночной пластине. Добавьте 30 миллилитров среды R-10, дополненной человеческим интерлейкином-2 и человеческим интерлейкином-15, к той же 6-луночной пластине и инкубируйте пластину при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом, заменяя среду каждые 3-4 дня.
Во время инкубации регистрируйте общий естественный киллер периферической крови, или PBNK, жизнеспособность числа клеток и выполняйте проточную цитометрию каждые 3-4 дня, чтобы рассчитать скорость расширения NK-клеток. Добавьте 1,8 x 10 к 6-й ячейке 293T в 11 миллилитрах среды D-10 на обработанную 100-миллиметровую пластину и инкубируйте ячейки 293T при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа. В трубке объемом 1,70 миллилитра смешайте 470 микролитров восстановленной сывороточной среды с 30 микролитрами трансфекционного реагента.
В отдельной трубке объемом 1,70 миллилитра добавьте 2,5 микрограмма плазмиды pRDF, 3,75 микрограмма плазмиды Pegpam3 и 2,5 микрограмма конструкции CAR в векторе SFG в восстановленную сывороточную среду, чтобы получить конечный объем 500 микролитров. Смешайте содержимое трубки с 1,70 миллилитровой трубкой, приготовленной ранее по каплям. После 15 минут инкубации при комнатной температуре добавьте 1 миллилитр смеси из трубки на пластину ячейки 293T по каплям и поместите пластину при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение 48-72 часов.
Разбавить белок ретронектина PBS до конечной концентрации от 50 до 100 мкг на миллилитр. Добавьте 500 микролитров разбавленного ретронектина в каждую лунку необработанной 24-луночной пластины. Затем запечатайте пластину с помощью парапленки и инкубируйте пластину при 4 градусах Цельсия в течение ночи.
На следующий день центрифугируйте ретронектиновую пластину при 2, 103G в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия и выбросьте супернатант. После перекрытия каждой лунки 24-луночной пластины 1 миллилитра среды R-10 инкубируют пластину при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом в течение 1 часа. Фильтруйте ранее трансфектированные клетки 293T с помощью фильтра 0,45 микрона для сбора супернатанта ретровируса.
Aliquot 2 миллилитра фильтрованного ретровирусного супернатанта в каждую лунку 24-луночной ретронектиновой пластины. Центрифугируйте 24-луночную ретронектиновую пластину при 2, 103G в течение 2 часов в предварительно нагретую центрифугу при 32 градусах Цельсия. Пока пластины центрифугируются, соберите расширенные ячейки PBNK с 0-го дня и подсчитайте клетки с помощью Trypan Blue.
Разбавляют расширенные ПБНК-клетки средой R-10, дополненной интерлейкином-2 и интерлейкином-15, до концентрации от 2,5 х 10 до 5-й - 5 х 10 до 5-й клетки на миллилитр. После центрифугирования 24-луночной ретронектиновой пластины частично аспирируют супернатант ретровируса из каждой скважины. Затем добавьте 2 миллилитра разбавленных расширенных ПБНК-клеток к каждой лунке.
Центрифугируйте пластину при 600G в течение 10 минут при 32 градусах Цельсия, прежде чем инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом в течение 48-72 часов. Переместите ячейки из 24-луночной пластины в 50-миллилитровую центрифужную трубку, чтобы центрифугировать трубку при 400G в течение 5 минут. После повторного использования гранулы с 1 миллилитром среды R-10 переводят повторно суспендированные клетки на специальную 6-луночную пластину, содержащую 30 миллилитров среды R-10, дополненную интерлейкином-2 и интерлейкином-15.
Инкубируйте специальную 6-луночную пластину при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа с освежающей средой и рассчитывайте скорость расширения NK-клеток каждые 3-4 дня. Было показано, что ячейки PBNK, расширенные на 221-mIL-21, расширяются почти в 5 x 10 до 4-х раз. А чистота NK-клеток поддерживалась на уровне около 85% на протяжении всего 21-дневного расширения.
До расширения надежность системы расширения 221-mIL-21 исследовали путем окрашивания PBMCs для анти-CD56 и анти-CD3, что показало чистоту клеток 7,09% для NK-клеток и высокий процент Т-клеток. На 4-й день НБМК и кокультуры 221-mIL-21 чистота НК была проверена перед трансдукцией CAR-NK. Клетки CAR-NK, окрашенные для анти-CD56, анти-CD3 и анти-человека-IgG, показали высокую популяцию NK-клеток на 7-й день и наблюдалась высокая эффективность трансдукции CAR примерно 70%.
На 18-й день экспрессия CAR в различных подмножествах была проверена с помощью проточной цитометрии. После расширения NK-клеток клетки могут использоваться для функциональных анализов in vitro или для экспериментов in vivo. Исследователь может использовать этот протокол для расширения NK и CAR-NK для пациентов с функциональным дефицитом NK, а также для других видов, таких как собаки.
