يمكن تنفيذ هذه الطريقة في أي مختبر مجهز لتجارب زراعة الخلايا. باستخدام هذه الطريقة ، يمكننا تعزيز فهمنا لتطور الكلى ومسارات المرض. هذه طريقة بسيطة نسبيا وغير مكلفة مقارنة بغيرها لتوليد المواد العضوية في الكلى.
التحدي الأكبر لهذه التقنية هو الحفاظ على ثقافة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات عالية الجودة. من الأهمية بمكان أن يتم الحفاظ على الخلايا عند أقل من 80٪ من الالتقاء والانقسام بانتظام. يجب على الباحثين الجدد في زراعة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات التعرف على خطوط الخلايا الجذعية قبل الشروع في التمايز.
ابدأ فحص الكلى العضوي بإضافة ملليلترين من وسط E5-ILP الكامل في كل بئر من لوحة مرفقة منخفضة للغاية من ستة آبار. استزرع الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات، أو hPSCs، في صفائح معالجة بزراعة الأنسجة بقطر 100 ملليمتر حتى تصل إلى 60٪ من الالتقاء. اغسل hPSCs مرتين بحوالي ثمانية ملليلترات من DPBS.
استنشق DPBS ، ثم أضف ملليلترين من Dispase قطرة لتغطية الخلايا ، واحتضنها لمدة ست دقائق عند 37 درجة مئوية. اغسل الخلايا ثلاث مرات بحوالي 10 ملليلتر من DPBS. قم بشفط DPBS ، ثم قم بإمالة اللوحة بمقدار 45 درجة ، وكشط الخلايا لأسفل باستخدام رافع الخلايا.
اغسل المستعمرات من الأعلى بستة ملليلترات من وسط E5-ILP الكامل باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر. ثم ، مع الاحتفاظ بالماصة عموديا ، قم بتفتيت المستعمرات الكبيرة عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل ، مع الحرص على عدم لمس جوانب لوحة الثقافة. قم بتوزيع مجموعات المستعمرة بالتساوي عن طريق إضافة ملليلتر واحد لكل بئر إلى الصفيحة المكونة من ستة آبار ، ثم ضع الصفيحة على شاكر مداري داخل حاضنة 37 درجة مئوية.
بدلا من ذلك ، إذا لم يكن الاهتزاز المداري متاحا ، فيمكن زراعة الخلايا بشكل ثابت. في اليوم الثاني ، بعد ترك الأجسام الجنينية تستقر في أسفل اللوحة ، قم بإمالة اللوحة بمقدار 45 درجة ، وقم بشفط الوسط ببطء من الأعلى ، تاركا ملليلتر واحد لكل بئر. أضف ملليلترين من الوسط الكامل المحضر لكل بئر ، وأعد الطبق مرة أخرى إلى الخلاط.
في اليوم الثالث ، بعد شفط الوسط كما هو موضح سابقا ، قم بجمع جميع الأجسام الجنينية بعناية من كل بئر باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر ، ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر. لجمع أي أجسام جنينية متبقية، اشطف كل بئر بملليلتر واحد من DMEM منخفض الجلوكوز، وأضفها إلى نفس الأنبوب المخروطي سعة 50 ملليلتر. أثناء انتظار أن تستقر الأجسام الجنينية في قاع الأنبوب ، أضف ملليلترين من المرحلة الثانية المتوسطة إلى كل بئر من الصفيحة المكونة من ستة آبار.
بعد ذلك ، قم بغربلة الأجسام الجنينية الكبيرة عن طريق وضع مصفاة خلية بسعة 200 ميكرومتر فوق أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلتر وسحب جميع الأجسام الجنينية بعناية فوق مصفاة الخلية. شطف مصفاة الخلايا مع خمسة ملليلترات إضافية من DMEM لجمع أي أجسام جنينية عالقة في المصفاة. في مراحل لاحقة ، استخدم أولا مصفاة 500 ميكرومتر لغربلة الأجسام الجنينية الكبيرة جدا ، ثم مرر الترشيح عبر مصفاة 200 ميكرومتر لغربلة الأجسام الجنينية الصغيرة جدا بدون نبيبات.
اجمع الأجسام الجنينية ذات الحجم الصحيح ، بين 200 إلى 500 ميكرومتر ، عن طريق عكس مصفاة 200 ميكرومتر إلى أنبوب جديد سعة 50 ملليلتر وغسل المصفاة باستخدام DPBS. بعد الإجهاد ، اسمح للأجسام الجنينية بالاستقرار في قاع الأنبوب المخروطي ، ثم استنشاق السوبرناتانت ، وغسلها بحوالي 10 ملليلتر من DMEM. ثم ، أعد تعليق الأجسام الجنينية في ستة ملليلترات من المرحلة الثانية المتوسطة.
انقل الأجسام الجنينية مرة أخرى إلى صفيحة التعلق ذات الستة آبار المنخفضة للغاية ، وقم بتوزيعها بالتساوي بين الآبار. نظرا لأن معظم المواد العضوية تتجمع في الجزء العلوي من الماصة ، اترك ما يقرب من نصف ملليلتر في النهاية ، ثم المس الطرف بلطف إلى الوسائط في كل بئر ، مما يسمح للعضويات بالتدفق إلى البئر. انقل الأجسام الجنينية إلى قارورة دوارة سعة 125 ملليلتر مع 45 ملليلتر من المرحلة الثانية المتوسطة.
اضبط سرعة التحريك المغناطيسي على 120 دورة في الدقيقة ، وضع القارورة في الحاضنة. لإطعام الأجسام الجنينية أو عضويات الكلى ، دعها تستقر لفترة وجيزة في الجزء السفلي من القارورة الدوارة ، ثم ارفع الغطاء من ذراع جانب واحد من القارورة ، وضع ماصة الشفط في الداخل مع لمس الطرف للجدار الداخلي المعاكس. قم بزاوية الماصة ببطء لأسفل ، واستنشق ما يقرب من نصف الوسط.
قم بتجديده ب 20 ملليلتر من وسط المرحلة الثانية الطازج عن طريق سحبه من خلال نفس الفتحة. استخدم ملقط معقم طويل لوضع قضيب تحريك مغناطيسي واحد بعناية في كل بئر من صفيحة من ستة آبار ذات أجسام جنينية أو عضويات كلوية. ضع اللوحة على لوحة التحريك المغناطيسي ذات العجلات الست ، واضبط السرعة على 120 دورة في الدقيقة.
لكي تستقر قضبان التحريك المغناطيسي في موضعها وتبدأ في الدوران ، اضبط أولا مستوى الطاقة على 100. بمجرد أن تبدأ جميع القضبان في الدوران ، اخفض مستوى الطاقة إلى 25. الحفاظ على عضويات الكلى عن طريق تغيير نصف الوسط كما هو موضح سابقا.
التألق المناعي لأقسام البارافين في اليوم 14 تظهر عضويات الكلى وجود شرائح النيفرون مثل الأنابيب الكلوية التي تعبر عن العامل النووي لخلايا الكبد -1 بيتا ولوتس رباعي غونولوبوس ليكتين ، بالإضافة إلى مجموعات الخلايا البودوسية التي تعبر عن الساركوما الليفية العضلية العصبية V-maf المتجانسة الجينية B والنيفرين. يمكن أن تدعم التعديلات في هذا البروتوكول توسع الخلايا البطانية ، كما هو مؤكد من خلال تلطيخ الصفائح الدموية وجزيء التصاق الخلايا البطانية -1 في اليوم 26 من الثقافة. تحتاج الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى المعالجة باستخدام Dispase لفترة مناسبة من الوقت ، ثم غسلها جيدا لإزالة جميع الآثار.
إذا لم تتم إزالة Dispase بالكامل ، فقد يؤدي ذلك إلى موت الخلايا وتجميع الأجسام الجنينية. وقد ساعدتنا هذه الطريقة على دراسة تطور أمراض الكلى الخلقية، فضلا عن مختلف مسارات إصابات الكلى وإمكانية التدخلات العلاجية في المختبر.
