Этот метод может быть выполнен в любой лаборатории, оборудованной для экспериментов с клеточными культурами. Используя этот метод, мы можем углубить наше понимание развития почек и путей заболевания. Это относительно простой и недорогой метод по сравнению с другими для получения почечных органоидов.
Самой большой проблемой этого метода является поддержание высококачественной культуры плюрипотентных стволовых клеток человека. Очень важно, чтобы клетки поддерживались на уровне слияния менее 80% и регулярно расщеплялись. Исследователи, новички в культуре плюрипотентных стволовых клеток человека, должны ознакомиться с линиями стволовых клеток, прежде чем приступать к дифференцировке.
Начните анализ органоидов почек, добавив два миллилитра полной среды E5-ILP в каждую лунку шестилуночной сверхнизкой пластины прикрепления. Культивируйте человеческие плюрипотентные стволовые клетки, или hPSCs, в 100-миллиметровые пластины, обработанные культурой тканей, пока они не достигнут 60% слияния. Дважды промыть гПСК примерно восемью миллилитрами DPBS.
Аспирируйте DPBS, затем добавьте два миллилитра Dispase по каплям, чтобы покрыть клетки, и инкубируйте их в течение шести минут при 37 градусах Цельсия. Промыть клетки три раза примерно 10 миллилитрами DPBS. Аспирируйте DPBS, затем наклоните пластину на 45 градусов и соскоблите ячейки вниз с помощью подъемника ячеек.
Промыть колонии сверху шестью миллилитрами полной среды E5-ILP с помощью 10-миллилитровой серологической пипетки. Затем, удерживая пипетку вертикально, разбейте большие колонии, осторожно пипетируя вверх и вниз, следя за тем, чтобы не коснуться сторон культуральной пластины. Распределите кластеры колоний равномерно, добавив один миллилитр на лунку в шестилуночную пластину, а затем поместите пластину на орбитальный шейкер внутри инкубатора с температурой 37 градусов Цельсия.
Альтернативно, если орбитальный шейкер недоступен, клетки могут быть статически культивированы. На второй день, позволив эмбриоидным телам осесть в нижней части пластины, наклоните пластину на 45 градусов и медленно аспирируйте среду сверху, оставляя один миллилитр на лунку. Добавьте два миллилитра подготовленной полной среды на лунку и верните тарелку обратно в шейкер.
На третий день, после аспирации среды, как было показано ранее, тщательно соберите все эмбриональные тела из каждой лунки, используя 10-миллилитровую серологическую пипетку, и перенесите их в 50-миллилитровую коническую трубку. Чтобы собрать все оставшиеся эмбриоидные тела, промыть каждую лунку одним миллилитром низкоглюкообразного ДМЭМ и добавить их в ту же 50-миллилитровую коническую трубку. Ожидая, пока эмбриоидные тела осядут на дне трубки, добавьте два миллилитра среды II стадии к каждой лунке шестилуночной пластины.
Затем просеивайте большие эмбриоидные тела, помещая 200-микрометровый клеточный сеток поверх новой 50-миллилитровой конической трубки и тщательно пипетируя все эмбриоидные тела над клеточным сетчатым фильтром. Промыть клеточный ситечко дополнительными пятью миллилитрами DMEM, чтобы собрать любые эмбриональные тела, застрявшие в ситечке. На более поздних стадиях сначала используйте 500-микрометровый сетчатый фильтр для отслаивания очень больших эмбриональных тел, затем пропустите фильтрат через 200-микрометровое ситечко, чтобы отсеять очень маленькие эмбриональные тела без канальцев.
Соберите эмбриональные тела правильного размера, от 200 до 500 микрометров, путем инвертирования 200-микрометрового сетчатого фильтра в новую 50-миллилитровую трубку и промывки сетчатого фильтра DPBS. После процеживания дайте эмбриоидным телам осесть на дно конической трубки, затем аспирируйте супернатант и промыть примерно 10 миллилитрами DMEM. Затем повторно суспендируют эмбриоидные тела в шести миллилитрах среды стадии II.
Перенесите эмбриоидные тела обратно в шестилуночную сверхнизкую пластину крепления, равномерно распределив их между скважинами. Поскольку большинство органоидов собираются в верхней части пипетки, оставьте примерно половину миллилитра на конце, затем осторожно прикоснитесь кончиком к среде в каждой лунке, позволяя органоидам течь в лунку. Перенесите эмбриоидные тела в 125-миллилитровую колбу с 45 миллилитрами среды II стадии.
Установите магнитную скорость перемешивания на 120 об/мин и поместите колбу в инкубатор. Чтобы накормить эмбриоидные тела или почечные органоиды, дайте им ненадолго осесть на дно колбы спиннера, затем поднимите крышку с одного бокового рычага колбы и поместите аспирационную пипетку внутрь с наконечником, касающимся противоположной внутренней стенки. Медленно наклоните пипетку вниз и аспирируйте примерно половину среды.
Пополняйте 20 миллилитрами свежей среды Stage II, пипетируя ее через то же отверстие. Используйте длинные стерильные щипцы, чтобы аккуратно поместить один магнитный перемешивание в каждую лунку шестилуночной пластины с эмбриональными телами или почечными органоидами. Поместите пластину на шестиколесную магнитную перемешиваемую пластину и установите скорость 120 об/мин.
Чтобы магнитные перемешивания защелкнулись и начали вращаться, сначала установите уровень мощности на 100. Как только все брусья начнут вращаться, уменьшите уровень мощности до 25. Поддерживайте органоиды почек, изменяя половину среды, как было продемонстрировано ранее.
Иммунофлуоресценция парафиновых срезов органоидов почек 14-го дня показывает наличие сегментов нефронов, таких как почечные канальцы, экспрессирующие ядерный фактор гепатоцитов-1 бета и лектин тетрагонолоба лотоса, а также кластеры подоцитов, экспрессирующие V-маф мускулоапоневротическую фибросаркому онкогенный гомолог В и нефрин. Модификации в этом протоколе могут поддерживать расширение эндотелиальных клеток, что подтверждается окрашиванием молекулой адгезии тромбоцитов и эндотелиальных клеток-1 на 26-й день культуры. Человеческие плюрипотентные стволовые клетки необходимо обрабатывать Диспазой в течение соответствующего количества времени, а затем тщательно промыть, чтобы удалить все следы.
Если Диспаза не полностью удалена, это может привести к гибели клеток и кластеризации эмбриональных тел. Этот метод помог нам изучить развитие врожденных заболеваний почек, а также различные пути повреждения почек и потенциал для терапевтических вмешательств in vitro.
