Este método pode ser realizado em qualquer laboratório equipado para experimentos de cultura celular. Usando este método, podemos aprofundar nossa compreensão do desenvolvimento renal e caminhos da doença. Este é um método relativamente simples e barato comparado com outros para gerar organoides renais.
O maior desafio dessa técnica é manter a cultura de células-tronco pluripotentes humanas de alta qualidade. É fundamental que as células sejam mantidas com menos de 80% de confluência e divididas regularmente. Pesquisadores novos na cultura de células-tronco pluripotentes humanos devem se familiarizar com as linhas de células-tronco antes de proceder à diferenciação.
Inicie o ensaio organoide renal adicionando dois mililitros de meio E5-ILP completo em cada poço de uma placa de fixação ultra-baixa de seis poços. Cultura células-tronco pluripotentes humanas, ou hPSCs, em placas tratadas com cultura tecidual de 100 milímetros até atingirem 60% de confluência. Lave os hPSCs duas vezes com aproximadamente oito mililitros de DPBS.
Aspire o DPBS, em seguida, adicione dois mililitros de Dispase dropwise para cobrir as células, e incuba-los por seis minutos a 37 graus Celsius. Lave as células três vezes com aproximadamente 10 mililitros de DPBS. Aspire o DPBS, depois incline a placa em 45 graus, e raspe as células com um levantador de células.
Lave as colônias do topo com seis mililitros de meio E5-ILP completo usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros. Em seguida, segurando a pipeta verticalmente, quebrar grandes colônias, gentilmente pipetting para cima e para baixo, tomando cuidado para não tocar os lados da placa de cultura. Distribua os aglomerados da colônia uniformemente adicionando um mililitro por poço na placa de seis poços, em seguida, coloque a placa em um agitador orbital dentro de uma incubadora Celsius de 37 graus.
Alternativamente, se um agitador orbital não estiver disponível, as células podem ser cultivadas estaticamente. No segundo dia, depois de deixar os corpos embrionários se instalarem na parte inferior da placa, incline a placa em 45 graus e aspire o meio lentamente a partir do topo, deixando um mililitro por poço. Adicione dois mililitros de meio completo preparado por poço, e devolva a placa de volta ao agitador.
No terceiro dia, depois de aspirar o meio como demonstrado anteriormente, colete todos os corpos embrionários cuidadosamente de cada poço usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros, e transfira-os para um tubo cônico de 50 mililitros. Para coletar quaisquer corpos embrióides restantes, enxágue cada poço com um mililitro de DMEM de baixa glicose, e adicione-os ao mesmo tubo cônico de 50 mililitros. Enquanto espera que os corpos embrionários se instalem na parte inferior do tubo, adicione dois mililitros de meio estágio II a cada poço da placa de seis poços.
Em seguida, peneirar grandes corpos embrióides colocando um coador de células de 200 micrômetros em cima de um novo tubo cônico de 50 mililitros e tubosto todos os corpos embrióides cuidadosamente sobre o coador celular. Enxágüe o coador celular com mais cinco mililitros de DMEM para coletar quaisquer corpos embrionários presos no coador. Em estágios posteriores, primeiro use um coador de 500 micrômetros para peneirar corpos embrionários muito grandes, em seguida, passar o filtrado através de um filtro de 200 micrômetros para peneirar corpos embrióides muito pequenos sem túbulos.
Colete o tamanho correto de corpos embrionários, entre 200 e 500 micrômetros, invertendo o filtro de 200 micrômetros em um novo tubo de 50 mililitros e lavando o coador com DPBS. Após o esforço, permita que os corpos embrionários se acomodem no fundo do tubo cônico, depois aspirem o sobrenante e lavem com aproximadamente 10 mililitros de DMEM. Em seguida, resuspende os corpos embrióides em seis mililitros do estágio II médio.
Transfira os corpos embrionários de volta para a placa de fixação ultra-baixa de seis poços, distribuindo-os uniformemente entre os poços. Como a maioria dos organoides coletam na parte superior da pipeta, deixe aproximadamente meio mililitro no final, em seguida, toque suavemente a ponta para a mídia em cada poço, permitindo que organoides fluam para dentro do poço. Transfira os corpos embrionários para um frasco rotador de 125 mililitros com 45 mililitros do meio estágio II.
Coloque a velocidade de agitação magnética a 120 rpm e coloque o frasco na incubadora. Para alimentar os corpos embrionários ou organoides renais, deixe-os se acomodar brevemente no fundo do frasco rotador, em seguida, levante a tampa de um braço lateral do frasco, e coloque a pipeta aspirante dentro com a ponta tocando a parede interna oposta. Angule lentamente a pipeta para baixo e aspire aproximadamente metade do meio.
Reabasteca com 20 mililitros de meio fresco estágio II, pipetando-o através da mesma abertura. Use longas fórceps estéreis para colocar cuidadosamente uma barra de agitação magnética em cada poço de uma placa de seis poços com corpos embrionários ou organoides renais. Coloque a placa na placa de agitação magnética de seis rodas e coloque a velocidade a 120 rpm.
Para que as barras de agitação magnética se posicionem e comecem a girar, primeiro defina o nível de potência para 100. Uma vez que todas as barras comecem a girar, abaixe o nível de energia para 25. Mantenha os organoides renais alterando metade do meio como demonstrado anteriormente.
A imunofluorescência de seções de parafina do dia 14 organoides renais mostram presença de segmentos de nefron, como túbulos renais expressando fator nuclear hepatocítico-1 beta e lectina de tetragonolobus lotus, bem como aglomerados podocyte expressando V-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma onco homogenelog B e nephrin. As modificações neste protocolo podem apoiar a expansão das células endoteliais, confirmadas pela coloração com plaqueta e molécula de adesão celular endotelial-1 no dia 26 da cultura. As células-tronco pluripotentes humanas precisam ser tratadas com dispase pelo tempo adequado e, em seguida, completamente lavadas para remover todos os vestígios.
Se a despase não for completamente removida, pode levar à morte celular e agrupamento de corpos embrionários. Este método nos ajudou a examinar o desenvolvimento de doenças renais congênitas, bem como várias vias de lesão renal e potencial para intervenções terapêuticas in vitro.
