يستخدم هذا البروتوكول الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لتمييزها إلى خلايا الرئة من أجل نموذج أمراض الرئة البشرية والتنمية في طبق. هذا البروتوكول مهم لأنه من الصعب الحصول على أنسجة الرئة البشرية الأولية وزراعة. المزايا الرئيسية للتمييز بين خلايا الرئة والخلايا الجذعية متعددة القدرات هو أن يكون لها إمدادات مستمرة من خلايا الرئة محددة لدراسة نمو الرئة البشرية والمرض.
ويمكن الحفاظ على هذه الخلايا في زراعة الخلايا لفترات طويلة من الزمن، ويمكن أن تكون cryopreserved للتطبيقات في المستقبل، ويمكن التلاعب وراثيا لدراسة الطفرات الجينية. إثبات الإجراء سيكون راشيل ماكفيكار، مرشحة لنيل درجة الدكتوراه من مختبري. قبل بدء التجربة، إذابة ببطء عامل نمو خفضت، أو GFR، الطابق السفلي مصفوفة غشاء المتوسطة على الجليد، وتمييعه في حجم متساو من DMEM F12 الباردة.
ضع نصائح P1000 في الثلاجة للاسترخاء قبل الاستخدام. بعد ذلك ، قم بتغليف كل بئر من لوحة بئر 12 مع 500 ميكرولتر من مصفوفة غشاء الطابق السفلي GFR 50٪ المتوسطة ، وإزالة أي خليط متوسط وفقاعات فائضة من الآبار. ضع لوحات البئر فوق الثلج الرطب أو الثلاجة عند أربع درجات مئوية لتعيينها لمدة 20 دقيقة، ثم قم بتحريك الطبق إلى حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
عندما تصل PSEs عالية التقاء 70٪، إضافة 10 ميكرومولار روك المانع Y27632 إلى الخلايا الجذعية المستحثة من قبل الإنسان متعدد القدرات، والانتظار ساعة قبل الانفصال. يستنشق وسائل الإعلام، وغسل الخلايا مرة واحدة مع PVS. فصل IPSCs بإضافة 500 ميكرولتر من مفرزة الخلية المتوسطة لكل بئر، واحتضان لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪.
بعد الحضانة، إضافة 500 ميكرولتر من الخلايا الجذعية تمرير المتوسطة لكل بئر. خلايا ماصة بلطف باستخدام تلميح P1000 للحصول على تعليق خلية واحدة. ثم نقل الخلايا المشتتة في أنبوب 15 ملليلتر والطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 300 مرة G.Following الطرد المركزي، يستنشق المتوسطة، وإعادة إنفاق بيليه الخلية مع ملليلتر واحد من وسائل الإعلام mTeSR زائد تكملها مع 10 مثبط روك ميكرومولار.
بعد عد الخلايا، إضافة مرتين 10 إلى IPSCs الخامس إلى كل بئر من 12 جيدا GFR لوحة مغلفة المتوسطة، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، يستنشق mTeSR Plus قبل إضافة endoderm نهائي، أو DE، وسائط التعريفي. في اليومين الثاني والثلاثة، قم بتغيير وسائط تعريف DE.
في اليوم الرابع، ابدأ تحريض AFE باستبدال وسائط DE التعريفية بوسط القاعدي الخالي من المصل. قم بتغيير متوسط AFE يوميا لمدة ثلاثة أيام قبل تحليل كفاءة AFE في نهاية اليوم السادس. في اليوم السابع، إذابة GFR الطابق السفلي مصفوفة مصفوفة المتوسطة على الجليد لاستخدامها في وقت لاحق.
في وقت واحد، والمضي قدما مع الرئة سلف التمايز الخلية عن طريق التجسس وسائل الإعلام AFE وغسل الآبار مع PVS. إضافة ملليلتر واحد من محلول مفرزة الخلية إلى البئر واحتضان لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية. بعد الحضانة، أضف ملليلتر واحد من وسائل الإرواء إلى الآبار التي تحتوي على محلول مفرزة الخلية.
الحفاظ على الخلايا والمجاميع عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا. تأكد من إزاحة جميع الخلايا، ولكن لنقلها إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر للطرد المركزي بمعدل 300 مرة G لمدة خمس دقائق. إزالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في وسائل الإعلام التعريفي LPC.
عد الخلايا، وإضافة 2.5 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة إلى 100 ميكرولتر من البارد GFR مصفوفة غشاء الطابق السفلي المتوسطة، وتخلط جيدا. ضع قطرة في بئر من طبق من 12 بئرا واحتضنها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من وسائط LPC لكل بئر ، مما يضمن أن الانخفاض المتوسط مغمور بالكامل واحتضانه بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
في اليوم الثامن، تغيير LPC المتوسطة لإزالة مثبط ROCK Y27632. استمر في تغيير الوسائط كل يومين وحلل كفاءة LPC في نهاية اليوم 16. في اليوم 17، اغسل الآبار وأضف 500 ميكرولتر من ميكروغرامين لكل ملليلتر.
ماصة خليط ديسباس مع ماصة P1000 واحتضان لمدة 15 دقيقة، ثم ماصة الخليط واحتضان لمدة 15 دقيقة أخرى. بعد الحضانة، أضف ملليلتر واحد من وسائط التبريد إلى التفكيك الذي يحتوي على آبار، ونقل الخلايا إلى أنابيب مخروطية. الطرد المركزي وإعادة إنفاق بيليه في ملليلتر واحد من PVS المبردة، ثم كرر الطرد المركزي.
ثم إعادة إنفاق بيليه في ملليلتر واحد من الخلية مفرزة المتوسطة. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة، ثم إضافة حجم متساو من وسائل الإعلام التبريد والطرد المركزي مرة أخرى. Resuspend بيليه في ملليلتر واحد من وسائل الإعلام التبريد و 10 ميكرومولار روك المانع Y27632.
إجراء عدد خلايا لحساب حجم المطلوبة للحصول على ثماني مرات 10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر. ثم aliquot المطلوبة حجم المجاميع الخلية LPC في أنابيب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر الصغيرة، والطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 300 مرة G.Remove supernatant الزائدة دون إثارة بيليه الخلية، وترك 10 ميكرولتر من الوسائط المتبقية. Resuspend بيليه الخلية في 200 ميكرولتر من البارد GFR مصفوفة غشاء الطابق السفلي المتوسط ونقل الخلايا إلى إدراج غشاء ثقافة الخلية.
احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة. بعد الحضانة، إضافة ملليلتر واحد من 3D organoid التعريفي المتوسطة إلى غرفة القاعدية من إدراج، واستبداله مع المتوسطة الطازجة كل يومين لمدة ستة أيام. في اليوم 23، قم بتبديل المتوسط إلى متوسط التفريع ثلاثي الأبعاد، ثم قم بتغيير الوسط كل يومين لمدة ستة أيام.
في اليوم 29، قم بالتغيير إلى متوسط نضوج ثلاثي الأبعاد، ومواصلة استبدال الوسط كل يومين للأيام الستة التالية. في اليوم الرابع من تحريض DE ، تعرض الخلايا المرفقة مورفولوجيا مرصوفة بالحصى مدمجة. وأعرب عن علامات endoderm نهائي CXCR4 وS SOX17 مضافا مع نواة، مما يؤكد التمايز endodermal.
تم تأكيد تحريض فورجوت الأمامي في اليوم السابع مع مورفولوجيا تظهر خلايا مضغوطة بإحكام أكثر ، وعلامات FOXA2 و SOX2 مضافة مع النواة. تم تأكيد توليد خلايا سلف الرئة ثلاثية الأبعاد مع كرويدات ثلاثية الأبعاد ، والتعبير الداخلي عن NKX2-1 GFP في خط خلية المراسل. بعد ثلاثة أسابيع من التمايز إلى أعضاء الرئة بأكملها ، تم تحليل علامات الرئة عن طريق الكيمياء المناعية.
علامات لتفرع مورفوجينيسيس SOX2 و SOX9 مضافا إليها نواة لوحظ في organoids. تم الكشف بنجاح عن علامات الرئة القريبة P63 و KRT5 ، وكلاهما علامات الخلايا القاعدية ، جنبا إلى جنب مع SCGB3A2 ، وهو علامة لخلايا النادي. علامات الرئة البعيدة المستحثة برو SPC وعلامات SPB لخلايا Alveolar النوع الثاني.
وعلامات هوبإكس من خلايا النوع الأول الحويصلات. بالإضافة إلى ذلك، تم التعبير عن NKX2-1 وZO1 مضافا إليها النوى. علامات خلايا الرئة Mesenchyme PGFR ألفا، علامة للخلايا الليفية، وأعرب المشترك مع SOX9، يمثل mesenchyme البعيدة.
كما أعرب عن فيمنتين وتشتت في جميع أنحاء الرئة. بعد هذا الإجراء ، يمكن استثمار أعضاء الرئة مع الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا البطانية والمناعية. يحدث تطور الرئة والمرض عن طريق الإشارة بين مجموعات الخلايا الظهارية والنسنشية ، ولكن أيضا من الخلايا البطانية وال الضامة.
نظام نموذج أنسجة الرئة ثلاثية الأبعاد وثيق الصلة سريريا لدراسة الأمراض البشرية والعلاجات.
