Ce protocole utilise des cellules souches pluripotentes induites pour les différencier en cellules pulmonaires afin de modéliser la maladie pulmonaire humaine et son développement dans une boîte. Ce protocole est important car il est difficile d’obtenir et de cultiver du tissu pulmonaire humain primaire. Les principaux avantages de différencier les cellules pulmonaires des cellules souches pluripotentes sont d’avoir un approvisionnement constant en cellules pulmonaires spécifiques pour étudier le développement et la maladie pulmonaires humaines.
Ces cellules peuvent être maintenues en culture cellulaire pendant de longues périodes, peuvent être cryoconservées pour de futures applications et peuvent être génétiquement manipulées pour étudier les mutations génétiques. Rachel McVicar, une candidate au doctorat de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Avant de commencer l’expérience, décongelez lentement un milieu de matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit, ou DFG, sur de la glace et diluez-le dans un volume égal de DMEM F12 froid.
Placez les embouts P1000 au congélateur pour les refroidir avant utilisation. Ensuite, recouvrez chaque puits d’une plaque de 12 puits avec 500 microlitres du milieu de matrice de membrane basale à 50% GFR et éliminez tout mélange de milieu et les bulles en excès des puits. Placez les plaques de puits sur de la glace humide ou un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pour les régler pendant 20 minutes, puis déplacez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit.
Lorsque les EPS atteignent 70 % de confluence, ajoutez 10 micromolaires inhibiteur de ROCK Y27632 aux cellules souches pluripotentes induites par l’homme et attendez une heure avant la dissociation. Aspirez le milieu et lavez les cellules une fois avec PVS. Dissocier les IPSC en ajoutant 500 microlitres de milieu de détachement cellulaire par puits, et incuber pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5% de dioxyde de carbone.
Après l’incubation, ajouter 500 microlitres de milieu de passage de cellules souches par puits. Pipettez doucement les cellules à l’aide d’une pointe P1000 pour obtenir une suspension à cellule unique. Transférez ensuite les cellules dissociées dans un tube de 15 millilitres et centrifugez-les pendant cinq minutes à 300 fois G.Après centrifugation, aspirez le milieu et remettez en suspension la pastille cellulaire avec un millilitre de milieu mTeSR Plus complété par un inhibiteur de ROCK 10 micromolaires.
Après avoir compté les cellules, ajoutez deux fois 10 aux cinquièmes IPSC à chaque puits d’une plaque recouverte de GFR de 12 puits et incubez pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, aspirez le mTeSR Plus avant d’ajouter un milieu d’induction endodermique définitif, ou DE. Les deuxième et troisième jours, changez le support d’induction DE.
Le quatrième jour, commencez l’induction de l’AFE en remplaçant le milieu d’induction DE par un milieu basal sans sérum. Changez quotidiennement le support AFE pendant trois jours avant d’analyser l’efficacité AFE à la fin du sixième jour. Le septième jour, décongelez le milieu de la matrice de membrane basale GFR sur la glace pour une utilisation ultérieure.
Simultanément, procéder à la différenciation des cellules progénitrices pulmonaires en aspirant le milieu AFE et en lavant les puits avec PVS. Ajouter un millilitre de solution de détachement cellulaire au puits et incuber pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, ajouter un millilitre de milieu de trempe aux puits contenant une solution de détachement cellulaire.
Gardez les cellules sous forme d’agrégats en pipetant doucement de haut en bas. Assurez-vous que toutes les cellules sont délogées, mais pour les transférer dans un tube conique de 15 millilitres pour la centrifugation à 300 fois G pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille de cellule dans un milieu d’induction LPC.
Comptez les cellules, ajoutez 2,5 fois 10 aux cinquièmes cellules à 100 microlitres de milieu de matrice de membrane basale GFR froid, et mélangez bien. Placer une gouttelette dans un puits d’une plaque de 12 puits et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes. Ensuite, ajoutez un millilitre de média LPC par puits, en veillant à ce que la goutte moyenne soit complètement submergée et incubée pendant la nuit à 37 degrés Celsius.
Le huitième jour, changez le milieu LPC pour éliminer l’inhibiteur de ROCK Y27632. Continuez à changer les médias tous les deux jours et analysez l’efficacité du LPC à la fin du jour 16. Le jour 17, lavez les puits et ajoutez 500 microlitres de deux microgrammes par millilitre de dispase.
Pipette le mélange de dispase avec une pipette P1000 et incuber pendant 15 minutes, puis pipette le mélange et incuber pendant encore 15 minutes. Après l’incubation, ajoutez un millilitre du milieu de trempe aux puits contenant de la dispase et transférez les cellules dans des tubes coniques. Centrifugez et remettez en suspension la pastille dans un millilitre de PVS réfrigéré, puis répétez la centrifugation.
Ensuite, remettez en suspension la pastille dans un millilitre de milieu de détachement cellulaire. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 12 minutes, puis ajouter un volume égal de milieu de trempe et centrifuger à nouveau. Remettre en suspension la pastille dans un millilitre de milieu de trempe et 10 micromolaires inhibiteur de ROCK Y27632.
Effectuez un comptage de cellules pour calculer le volume nécessaire pour obtenir huit fois 10 à la quatrième cellule par puits. Ensuite, aliquote a nécessité le volume d’agrégats de cellules LPC dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre, et centrifugez pendant cinq minutes à 300 fois G.Éliminez l’excès de surnageant sans agiter la pastille de cellule, laissant 10 microlitres de milieu résiduel. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 200 microlitres de milieu de matrice de membrane basale GFR froid et transférer les cellules dans des inserts de membrane de culture cellulaire.
Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes. Après l’incubation, ajoutez un millilitre de milieu d’induction organoïde 3D à la chambre basolatérale de l’insert et remplacez-le par un milieu frais tous les deux jours pendant six jours. Le jour 23, passez le support au milieu de ramification 3D, puis changez le support tous les deux jours pendant six jours.
Le jour 29, passez au milieu de maturation 3D et continuez à remplacer le milieu tous les deux jours pendant les six jours suivants. Le quatrième jour de l’induction DE, les cellules attachées présentent une morphologie pavée compacte. Les marqueurs endodermiques définitifs CXCR4 et SOX17 superposés à des noyaux ont été exprimés, confirmant la différenciation endodermique.
L’induction de l’intestin antérieur a été confirmée le septième jour avec la morphologie montrant des cellules plus étroitement compactées, et les marqueurs FOXA2 et SOX2 superposés avec des noyaux. La génération de cellules progénitrices pulmonaires 3D a été confirmée avec des sphéroïdes 3D et l’expression endogène de NKX2-1 GFP dans une lignée cellulaire rapporteure. Après une différenciation de trois semaines en organoïdes pulmonaires entiers, les marqueurs pulmonaires ont été analysés par immunocytochimie.
Des marqueurs de morphogenèse ramifiée SOX2 et SOX9 superposés par des noyaux ont été observés dans les organoïdes. Les marqueurs pulmonaires proximaux P63 et KRT5, tous deux marqueurs des cellules basales, ont été détectés avec succès avec SCGB3A2, qui est un marqueur pour les cellules de club. Les marqueurs pulmonaires distaux ont induit des marqueurs Pro SPC et SPB pour les cellules alvéolaires de type II.
Et les marqueurs HOPX des cellules alvéolaires de type I. De plus, NKX2-1 et ZO1 ont été exprimés superposés avec des noyaux. Les marqueurs de cellules pulmonaires de mésenchyme PGFR Alpha, un marqueur pour les fibroblastes, co-exprimé avec SOX9, représentaient le mésenchyme distal.
Vimentin a également été exprimé et a été dispersé dans tout le poumon. Suite à cette procédure, les organoïdes pulmonaires peuvent être investis avec des cellules endothéliales et immunitaires dérivées de cellules souches pluripotentes induites. Le développement pulmonaire et la maladie se produisent par une signalisation entre les populations de cellules épithéliales et mésenchymateuses, mais aussi à partir de cellules endothéliales et de macrophages.
Un système de modèle de tissu pulmonaire 3D est cliniquement pertinent pour étudier les maladies humaines et les thérapies.
