على حد علمنا، هذا هو المثال الأول لبروتوكول متعدد المضاعفات قائم على الخرز يستخدم إشرتي مراسل لقياس نتيجتين لكل تحليل في وقت واحد. تسمح هذه التقنية للمستخدم بقياس IgM و IgG المحددين للمضاد في نفس الوقت ، مع عينة أقل ووقت أقصر للنتائج. في حين أن طريقة المراسل المزدوج هذه محددة ل isotyping الأجسام المضادة ، يمكن تكييفها لقياس أزواج التحليل الأخرى ، مثل التعديلات اللاحقة للترجمة أو أشكال الأدوية المجانية مقابل المقيدة.
مما يدل على إجراءاتنا اليوم لدينا الدكتور ستيف أنجيلوني، وهو عالم تطبيق ميداني كبير لشركة لومينيكس. لبدء المراسل المزدوج IgG و IgM المقايسة المصلية ، قم بإعداد مزيج حبة multix المطلوبة من حبة الزوجين الفردية والتحكم في مخزون الخرز بتركيز واحد × 10 إلى خرزات الستة لكل ملليلتر. بعد ذلك ، تمييع عينات المصل 100 مرة عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من المصل إلى 990 ميكرولتر من مخزن PBS-TBN المؤقت ، ثم تمييع العينات عشرة أضعاف أخرى عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من تخفيف 1:100 إلى 180 ميكرولتر من PBS-TBN.
عندما يمزج حبة وعينات المصل جاهزة، إضافة 50 ميكرولتر من حبة multix يمزج إلى الآبار المخصصة من لوحة microtiter 96 جيدا غير ملزمة، ثم إضافة 50 ميكرولتر من عينات المصل المخفف إلى الآبار المناسبة. بمجرد إضافة جميع العينات، قم بتغطية الطبق بختم رقائق صغيرة واحتضنه على شاكر لوحة ساخنة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم، فصل الخرز من خليط التفاعل عن طريق وضع لوحة على فاصل لوحة مغناطيسية لمدة دقيقتين.
حفظ لوحة على المغناطيس، وإزالة ختم احباط. ثم عكس بعناية لوحة على حاوية النفايات ونفض الغبار بلطف supernatant من الآبار. في حين لا يزال عقد لوحة على المغناطيس، لطخة لوحة على الورق ماصة.
لغسل آبار التفاعل، قم بإزالة اللوحة من مغناطيس اللوحة وأضف 150 ميكرولتر من PBS-TBN إلى كل بئر. غطي الطبق بختم رقائق طازج واحتضني شاكر ساخن لمدة دقيقتين قبل وضعه مرة أخرى على مغناطيس الطبق لمدة دقيقتين أخريين. مع الحفاظ على لوحة على المغناطيس، عكس لوحة لتجاهل supernatant، ولطخة لوحة على الورق ماصة.
بعد غسل PBS-TBN الثاني، قم بإزالة اللوحة من المغناطيس وأضف 100 ميكرولتر من مزيج كاشف الكشف الطازج إلى كل بئر. بعد تغطية اللوحة بختم رقائق ميكروبليت، ضعها على طبق ساخن شاكر لمدة 15 دقيقة، ثم على فاصل لوحة مغناطيسية لمدة دقيقتين. بينما تكون اللوحة على المغناطيس، تجاهل مزيج كاشف الكشف عن طريق عكس اللوحة فوق حاوية نفايات ونقعها على الورق الماصة.
غسل آبار رد الفعل مع برنامج تلفزيوني-TBN مرتين كما هو موضح سابقا، ثم إزالة لوحة من المغناطيس. إضافة 100 ميكرولتر من PBS-TBN إلى كل بئر، ثم تغطية لوحة مع ختم احباط ويهز لمدة دقيقتين في 37 درجة مئوية. إزالة ختم احباط والمضي قدما في قراءة 50 ميكرولتر من العينة من كل بئر في محلل التدفق.
لقراءة اللوحة، حدد القائمة المنسدلة في الزاوية العلوية اليسرى، وانتقل إلى تكوين اللوحة، ثم قم بتحميل اللوحة التي تم تكوينها مسبقا، وحدد تشغيل لوحة. أخرج حامل اللوحة عن طريق تحديد رمز الإخراج، ثم قم بتحميل اللوحة على حامل اللوحة وحدد رمز السحب لسحب حامل اللوحة. بمجرد أن تطول حاملة اللوحة إلى المحلل، حدد رمز التشغيل لبدء قراءة اللوحة.
بالنسبة لمقايسة تحييد المراسل المزدوج ، أضف 50 ميكرولتر من حبة متعددة إلى الآبار المخصصة للوحة microtiter غير ملزمة بشكل جيد ، ثم أضف 25 ميكرولتر من ميكروغرامين لكل ملليلتر ACE2 إلى كل بئر ، وغطى اللوحة بختم احباط. بعد حضانة لمدة دقيقتين على شاكر لوحة ساخنة، إضافة 25 ميكرولتر من تخفيف المصل 1:500 إلى الآبار المخصصة. بمجرد إضافة جميع العينات، قم بإجراء خطوات الحضانة والغسيل والكشف والتحليل كما سبق إثباتها للمقايسة المصلية.
اختبار المضادة IgM اقترانها صبغة مراسل DyLight 405 باستخدام عينات المصل في غضون خمسة إلى 60 يوما من ظهور الأعراض وعينة مصل الشريط IgG لم تنتج إشارة عالية لمضاد ارتفاع. بالنسبة للعينات ذات كثافة الفلورسينس المتوسطة عالية IgM ، شوهدت أعلى الإشارات للمجال الملزم للمستقبلات والمستضدات النووية. وفي حين كان ينبغي رفع معدل التر IgM في بعض العينات، فإن مستويات كثافة الفلورسينس المتوسطة الملاحظة لم تتجاوز 140 وحدة من وحدات MFI.
وعلاوة على ذلك، فإن حبة التحكم لIgM تفتقر إلى نطاق ديناميكي كبير لكثافة الفلورسينس المتوسطة عند استخدام DyLight 405 المترافق مع مضاد IgM مقارنة بالفيكوريثرين المسمى المضاد IgM بنفس التركيز. للكشف عن IgG ، كان اقتران البنفسجي الرائع أعلى متوسط إشارات كثافة الفلورسينس من اقتران streptavidin من الفلورية سوبر برايت 436. ومع ذلك ، فإن كثافة الإشارة للموازوج البنفسجي الرائعة اختلفت عبر المعايرة ACE2.
هذا التقلب إشارة من قبل اقتران البنفسجي الرائعة عبر تركيزات ACE2 تدخلت أيضا مع تحديد تثبيط في المئة من قبل ACE2 عبر مجموعة من تيتر IgG. للكشف عن IgM، عرض phycoerythrin المضادة IgM إشارات أعلى من تلك التي تم إنشاؤها بواسطة DyLight 549 المضادة للإنسان IgM. أثناء تحديد تثبيط ACE2 في المئة من ربط IgM ، كان هناك فرق طفيف ولكن ضئيل بين كاشفي الكشف IgM.
لذا فإن إحدى أهم الخطوات في الإجراء هي إعداد مزيج الخرز المتعدد من مخزون حباتك الفردية والتأكد من القيام بذلك بشكل صحيح. لذلك يمكن أيضا استخدام هذا الإجراء لقياس فعالية اللقاحات ورصد الاستجابات المناعية لمسببات الأمراض الأخرى أيضا.
