Per quanto ne s knowledge, questo è il primo esempio di un protocollo multiplexing basato su perle che utilizza due segnali reporter per misurare contemporaneamente due risultati per analita. Questa tecnica consente all'utente di misurare IgM e IgG antigene-specifiche allo stesso tempo, con meno campione e un tempo più breve per i risultati. Mentre questo metodo dual reporter è specifico per l'isotipizzazione degli anticorpi, potrebbe essere adattato per misurare altre coppie di analiti, come modifiche post-traduzionali o forme di farmaci liberi rispetto a quelli legati.
A dimostrare la nostra procedura oggi abbiamo il Dr.Steve Angeloni, uno scienziato senior delle applicazioni sul campo per Luminex Corporation. Per iniziare il test sierologico IgG e IgM a doppio reporter, preparare le miscele di perle multiplex richieste dalle singole perle di coppia e controllare le scorte di perle ad una concentrazione di una volta 10 alle sei perle per millilitro. Quindi, diluire i campioni di siero di 100 volte aggiungendo 10 microlitri di siero a 990 microlitri di tampone PBS-TBN, quindi diluire i campioni di altre dieci volte aggiungendo 20 microlitri della diluizione 1:100 a 180 microlitri di PBS-TBN.
Quando le miscele di perle e i campioni di siero sono pronti, aggiungere 50 microlitri delle miscele di perle multiplex ai pozzetti assegnati di una piastra microtiter non legante a 96 pozzetti, quindi aggiungere 50 microlitri dei campioni di siero diluito ai pozzetti appropriati. Una volta aggiunti tutti i campioni, coprire la piastra con un sigillo di lamina micropiastra e incubare su uno shaker a piastra riscaldata a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi, separare le perle dalla miscela di reazione posizionando la piastra su un separatore di piastre magnetiche per due minuti.
Mantenendo la piastra sul magnete, rimuovere il sigillo della lamina. Quindi capovolgere con cura la piastra su un contenitore per i rifiuti e far scorrere delicatamente il surnatante fuori dai pozzetti. Mentre si tiene ancora la piastra sul magnete, asciugare la piastra su carta assorbente.
Per lavare i pozzi di reazione, rimuovere la piastra dal magnete della piastra e aggiungere 150 microlitri di PBS-TBN a ciascun pozzo. Coprire la piastra con un sigillo di alluminio fresco e incubare sullo shaker riscaldato per due minuti prima di rimetterlo sul magnete della piastra per altri due minuti. Mantenendo la piastra sul magnete, invertire la piastra per scartare il surnatante e tamponare la piastra su carta assorbente.
Dopo il secondo lavaggio PBS-TBN, rimuovere la piastra dal magnete e aggiungere 100 microlitri di miscela fresca di reagente di rilevamento a ciascun pozzo. Dopo aver coperto la piastra con un sigillo di lamina micropiastra, posizionarla su uno shaker a piastra riscaldata per 15 minuti, quindi su un separatore di piastre magnetiche per due minuti. Mentre la piastra è sul magnete, scartare la miscela di reagenti di rilevamento invertendo la piastra su un contenitore di rifiuti e tamponandola su carta assorbente.
Lavare i pozzi di reazione con PBS-TBN due volte come precedentemente dimostrato, quindi rimuovere la piastra dal magnete. Aggiungere 100 microlitri di PBS-TBN a ciascun pozzo, quindi coprire la piastra con guarnizione di alluminio e agitare per due minuti a 37 gradi Celsius. Rimuovere il sigillo della lamina e procedere alla lettura di 50 microlitri del campione da ciascun pozzo nell'analizzatore di flusso.
Per leggere la piastra, selezionare il menu a discesa nell'angolo in alto a sinistra, passare a Configurazione piastra, caricare la piastra configurata in precedenza e selezionare Esegui piastra. Espellere il portapiasle selezionando l'icona Espelli, quindi caricare la piastra sul supporto piastre e selezionare l'icona Retract per ritrarre il portapiatti. Una volta che il supporto della piastra si è protratto nell'analizzatore, selezionare l'icona Esegui per iniziare a leggere la piastra.
Per il test di neutralizzazione a doppio reporter, aggiungere 50 microlitri delle miscele di perle multiplex ai pozzetti assegnati di una piastra microtitolatore non vincolante a 96 pozzetti, quindi aggiungere 25 microlitri di due microgrammi per millilitro ACE2 a ciascun pozzetto e coprire la piastra con un sigillo di lamina. Dopo un'incubazione di due minuti su uno shaker a piastre riscaldate, aggiungere 25 microlitri di diluizioni sieriche 1:500 ai pozzetti assegnati. Una volta aggiunti tutti i campioni, eseguire le fasi di incubazione, lavaggio, rilevamento e analisi come precedentemente dimostrato per il test sierologico.
Un test di anti-IgM coniugato al colorante reporter DyLight 405 utilizzando campioni di siero entro cinque-60 giorni dall'insorgenza dei sintomi e un campione di siero a striscia IgG non ha prodotto un segnale elevato per l'antigene spike. Per i campioni con un'elevata intensità di fluorescenza media IgM, sono stati osservati i segnali più alti per il dominio di legame del recettore e gli antigeni nucleocapsidi. Mentre il titolo IgM avrebbe dovuto essere elevato in alcuni campioni, i livelli di intensità di fluorescenza media osservati non superavano le 140 unità MFI.
Inoltre, il perle di controllo per IgM mancava di un intervallo dinamico significativo per l'intensità mediana di fluorescenza quando si utilizzaVa DyLight 405 coniugato ad anti-IgM rispetto a un anti-IgM etichettato con ficoeritrina alla stessa concentrazione. Per il rilevamento di IgG, il coniugato viola brillante aveva segnali di intensità di fluorescenza mediana più elevati rispetto al coniugato di streptavicina del fluorforo Super Bright 436. Tuttavia, l'intensità del segnale per il coniugato viola brillante variava tra le titolazioni ACE2.
Questa fluttuazione del segnale da parte del coniugato viola brillante attraverso le concentrazioni di ACE2 ha anche interferito nel determinare l'inibizione percentuale da parte di ACE2 attraverso la gamma di titoli IgG. Per il rilevamento di IgM, l'anti-IgM di ficoeritrina ha mostrato segnali più elevati di quelli generati da DyLight 549 IgM anti-umano. Durante la determinazione dell'inibizione ACE2% del legame IgM, c'era una leggera ma insignificante differenza tra i due reagenti di rilevamento IgM.
Quindi uno dei passaggi più importanti della procedura è preparare il mix di perle multiplex dalle singole scorte di perle e assicurarsi di farlo correttamente. Quindi questa procedura può essere utilizzata anche per misurare l'efficacia dei vaccini e monitorare le risposte immunitarie ad altri agenti patogeni.
