私たちの知る限りでは、これは2つのレポーター信号を使用して同時に1つの検数法ごとに2つの結果を測定するビーズベースの多重化プロトコルの最初の例です。この技術により、抗原特異的IgMとIgGを同時に測定することができ、サンプルの数が少なく、結果までの時間が短くなります。このデュアルレポーター法は抗体アイソタイピングに特異的であるが、翻訳後修飾や自由結合薬物形態などの他の分析対象の対を測定するように適応することができる。
今日の手順をデモンストレーションすると、Luminex Corporationのシニアフィールドアプリケーションサイエンティストであるスティーブ・アンジェロニ博士が参加しています。デュアルレポーターIgGとIgM血清学的アッセイを開始するには、個々のカップルビーズから必要なマルチプレックスビーズミックスを調製し、1ミリリットル当たり6個のビーズに1倍の濃度でビーズストックを制御します。次に、血清サンプルを10マイクロリットルのPBS-TBNバッファーの990マイクロリットルに加えて100倍希釈し、1:100希釈の20マイクロリットルをPBS-TBNの180マイクロリットルに加えてさらに10倍に希釈します。
ビーズミックスと血清サンプルの準備ができたら、96ウェル非結合マイクロタイタープレートの割り当てられた井戸に多重ビーズミックスの50マイクロリットルを追加し、希釈された血清サンプルの50マイクロリットルを適切なウェルに追加します。すべてのサンプルを追加したら、マイクロプレートホイルシールでプレートを覆い、加熱プレートシェーカーで37°Cで15分間インキュベートします。次いで、2分間の磁気プレート分離器にプレートを置くことによって反応混合物からビーズを分離する。
プレートを磁石の上に置いたままにして、ホイルシールを取り外します。その後、慎重に廃棄物容器の上にプレートを反転し、穏やかに井戸から上清をフリック。磁石の上にプレートを保持したまま、吸収性の紙にプレートをブロットします。
反応ウェルを洗浄するには、プレート磁石からプレートを取り出し、各ウェルに150マイクロリットルのPBS-TBNを加えます。新鮮なホイルシールでプレートを覆い、加熱されたシェーカーで2分間インキュベートしてから、さらに2分間プレートマグネットに戻します。磁石の上にプレートを保持しながら、上清を捨てるプレートを反転し、吸収性の紙にプレートをブロットします。
2回目のPBS-TBN洗浄後、磁石からプレートを取り出し、各ウェルに新鮮な検出試薬ミックスの100マイクロリットルを加えます。プレートをマイクロプレートホイルシールで覆った後、加熱プレートシェーカーの上に15分間置き、次いで磁気プレートセパレータに2分間置きます。プレートが磁石の上にある間、廃容器の上にプレートを反転させ、吸収性紙に吸い込んで検出試薬ミックスを捨てます。
前に実証された2回PBS-TBNで反応ウェルを洗浄し、磁石からプレートを取り除きます。各井戸にPBS-TBNの100マイクロリットルを追加し、ホイルシールでプレートを覆い、37°Cで2分間振ります。ホイルシールを取り外し、フローアナライザ内の各ウェルからサンプルの50マイクロリットルを読み取るに進みます。
プレートを読み込むには、左上隅のドロップダウン メニューを選択し、[プレート構成]に移動して、以前に設定したプレートをロードして、[プレートを実行]を選択します。イジェクト アイコンを選択してプレート キャリアを取り出し、プレートキャリアにプレートをロードし、プレートキャリアを引き込むには、リトラクト アイコンを選択します。プレートキャリアがアナライザーに長引いたら、[実行]アイコンを選択してプレートの読み取りを開始します。
デュアルレポーター中和アッセイの場合は、96ウェル非結合マイクロタイタープレートの割り当てられた井戸に多重ビーズミックスの50マイクロリットルを追加し、各ウェルに1ミリリットルACE2あたり2マイクログラムの25マイクロリットルを追加し、ホイルシールでプレートを覆います。加熱プレートシェーカーで2分間のインキュベーションの後、割り当てられたウェルに25マイクロリットルの1:500血清希釈液を加えます。すべてのサンプルを追加したら、血清学的アッセイで既に示したようにインキュベーション、洗浄、検出、および分析のステップを実行します。
症状発症から5~60日以内に血清サンプルを用いてDyLight 405レポーター色素に結合した抗IgMの試験と、IgGストリップ血清サンプルはスパイク抗原に対して高いシグナルを生成しなかった。高いIgM培地蛍光強度のサンプルでは、受容体結合ドメインおよびヌクレオキャプシド抗原に対して最も高いシグナルが見られた。IgM価価は一部のサンプルで上昇しているはずですが、観察された中蛍光強度レベルは140 MFI単位を超えませんでした。
さらに、IgMの対照ビーズは、同じ濃度で標識されたフィコエリスリンと比較して、抗IgMにコンジュゲートされたDyLight 405を使用する場合の蛍光強度の中央値に対して有意なダイナミックレンジを欠いていた。IgG検出の場合、ブリリアントバイオレットコンジュゲートは、フルオルフォアスーパーブライト436のストレプトアビジンコンジュゲートよりも高い中央値蛍光強度信号を有していた。しかし、華麗なバイオレット共役の信号強度はACE2滴定にまたがって変化した。
このACE2濃度にわたるブリリアントバイオレット共役によるこの信号変動は、IgG価の範囲にわたるACE2による阻害率を決定する際にも干渉した。IgM検出では、フィコエリスリン抗IgMはDyLight 549抗ヒトIgMによって生成されたものよりも高い信号を表示しました。IgM結合のACE2パーセント阻害を決定する一方で、2つのIgM検出試薬の間にわずかな有意差があった。
したがって、手順の最も重要なステップの1つは、個々のビーズ株からマルチプレックスビーズミックスを準備し、それを正しく行う必要があります。したがって、この手順は、ワクチンの有効性を測定し、他の病原体に対する免疫応答を同様に監視するためにも使用することができます。
