بروتوكول FASP هو نهج مثير للاهتمام لعلم البروتيوميات البولية بسبب توافقه مع المخازن المؤقتة بشدة وبسبب قدرته على تركيز العينة على الفلتر ، وهو أمر بالغ الأهمية لعينات البروتين المخفف. يسمح لنا بروتوكول FASP إلى جانب قياس الطيف الكتلي للتحليل المستقل للبيانات بتحقيق تغطية البروتيوم العميقة في البول EPS ، وهو البول الذي يتم جمعه بعد فحص المستقيم الرقمي. نحن نطبق حاليا الطريقة التي أنت على وشك رؤيتها في جهد اكتشاف العلامات الحيوية حول سرطان البروستاتا.
وسوف تظهر الإجراء من قبل ليسيا بريستاغاياكومو، باولا موريلي وكاترينا غابرييل. عينات الطرد المركزي EPS البول في غضون ساعتين من جمع لمدة 10 دقائق في 2, 100 RCF في درجة حرارة الغرفة. ثم، تخزين المضادات الفائقة في ناقص 80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
رمي العينات على الجليد، أو في أربع درجات. لتسريع الإجراء، يمكنك نقل العينات من ناقص 80 إلى ناقص 20 في اليوم السابق للهضم. كحلول المخزون، وسوف تحتاج 500 ملليمولار DTT، 10٪ SDS، واحد الأضراس تريس العازلة في رقم الحموضة ثمانية.
تمييع 500 ميكرولتر من كل عينة من عينات البول EPS مع 67 ميكرولتر من SDS، 67 ميكرولتر من DTT و 33 ميكرولتر من العازلة تريس. احتضان في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق مع اهتزاز لطيف. تجميع وحدة تصفية الطرد المركزي مع 10،000 دالتون الوزن الجزيئي قطع.
ثم، إضافة 300 ميكرولتر من عينة EPS البول المخفف إلى مرشح. جهاز طرد مركزي في 14، 000 غرام لمدة 20 دقيقة تقريبا. يمكنك مقاطعة الإجراء مؤقتا بعد 15 دقيقة أو نحو ذلك للتحقق مما إذا كان الترشيح يسير بسلاسة.
استمر حتى يتم تمرير الحل بالكامل من خلال عامل التصفية. ثم أضف 200 ميكرولتر من عازل اليوريا والطرد المركزي عند 14,000 غرام لمدة 15 دقيقة. كرر هذه الخطوة مرة ثانية.
عندما تدفق من خلال على وشك لمس مرشح، إفراغ مجموعة Eppendorf عن طريق الأنابيب من خلال تدفق. البروتينات آمنة على الفلتر. بالنسبة للكيستين الألكيل، قم بإعداد محلول iodoacetamide قبل الاستخدام مباشرة.
تزن حوالي 10 ملليغرام من iodoacetamide في عدد Eppendorf قارورة وحله في العازلة اليوريا بتركيز 9.25 ملليغرام لكل مل، أو من حيث الضرس، 50 ملليمولار. إضافة 50 ميكرولتر من محلول iodoacetamide لكل فلتر وطارد مركزي في 6,000 غرام لمدة 25 دقيقة. سرعة الطرد المركزي أقل سوف تسمح للمرشحات لا لتشغيل الجافة.
بعد الألكيل البروتين، وغسل المرشحات مع اثنين على التوالي 200 ميكرولتر aliquots من العازلة اليوريا والطرد المركزي في 14، 000 غرام لمدة 20 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال. إضافة 200 ميكرولتر من 50 ملليمولار ثلاثة إيثيل الأمونيوم بيكربونات العازلة والطرد المركزي في 14,000 غرام لمدة 20 دقيقة.
كرر هذه الخطوة. بعد الانتهاء من غسل بيكربونات الماضي، نقل وحدة التصفية إلى أنبوب جمع جديدة. ثم، إضافة 60 ميكرولتر من 50 ملليمولار TEAB العازلة.
إضافة ميكرولتر واحد من محلول تريبسين بتركيز 200 نانوغرام لكل ميكرولتر من التريبسين. بدلا من ذلك، يمكنك تحضير المخزن المؤقت للهضم لجميع العينات في قارورة Eppendorf وتوزيع 61 ميكرولتر من المخزن المؤقت للهضم لكل فلتر. إذا كنت تستخدم ThermoMixer من أجل تجنب تبخر العينة أثناء الحضانة بين عشية وضحاها ، فقم بتغليف كل وحدة تصفية بطبقة من رقائق الألومنيوم ، ثم طبقة من البارافيلم.
احتضان العينات في 37 درجة بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، نقل المرشحات إلى جهاز طرد مركزي أعلى مقاعد البدلاء لتدور قصيرة جدا. بعد الغزل، افتح أغطية Eppendorf وأضف 140 ميكرولتر من الماء.
طرد مركزي قنينات في 14, 000 غرام لمدة 25 دقيقة, من أجل جمع الببتيدات. وينبغي أن يكون حجم جمع حوالي 190 ميكرولتر. من أجل إزالة آثار SDS من الهضم ، يوصى بتنقية تبادل cation قوي للببتيدات قبل LC-MS-MS.
إعداد أصحاب microcolumn عن طريق ثقب أغطية Eppendorf مع أداة حادة مثل زوج من ملاقط أو مقص. سيستوعب الحامل الميكروفون أثناء الطرد المركزي. نظرا لأنها مملة لإعداد ، يمكن استخدام أصحاب عدة مرات.
باستخدام حاد وإبرة، وإزالة لوحة من قرص الاستخراج المناسبة. أقراص الاستخراج هي مواد بوليمرية ناعمة تحتوي على جزيئات ماصة. في هذه الحالة، يرصد ماصة من الجسيمات مع خصائص تبادل cation قوية.
استيعاب اللوحة في تلميح ماصة 200 ميكرولتر. باستخدام المكبس دفع المكونات نحو نهاية الطرف. وينبغي دفع القرص الصغير بقوة ، ولكن تجنب القوة المفرطة.
أدخل الطرف في الحامل وتجميع ميكروكولون الدوران باستخدام قارورة إيبيندورف ملليلتر التي تمت إزالة الغطاء الأصلي منها. المكونات من إبرة قياس 16 سيكون لها قدرة التحميل من حوالي خمسة ميكروغرام من الببتيدات. شرط microcolumn مع اثنين من يغسل على التوالي.
ستعتمد السرعة المناسبة على مدى قوة دفع القرص إلى طرف ماصة. تهدف إلى تحقيق معدل تدفق في ترتيب 20 إلى 30 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة. حاول ألا يجف الطرف أثناء الغسيل وأثناء تحميل العينة.
تمييع العينة خمسة أضعاف في محلول الغسيل اثنين وتحميل النتائج في حل بسرعة أبطأ. تهدف إلى معدل تدفق من حوالي 15 إلى 20 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة. إذا لزم الأمر، تجاهل التدفق من خلال.
غسل المنظفات المتبقية. ثم، والسماح للقرص لتشغيل الجافة قبل الببتيد elution. نقل microcolumn إلى أنبوب نظيف 1.5 Eppendorf وإضافة على الفور eluent.
والتي ستكون سبعة ميكرولترات من محلول خلات الأمونيوم 500 ملليمولار التي تحتوي على 20٪ أسيتونيتريل. تمييع eluate مع 27 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪ من أجل خفض النسبة المئوية للمذيبات العضوية ومن ثم حقن اثنين من microliters من الحل الناتج في LC-MS-MS مع الكشف في وضع البيانات تعتمد. سيتم إعطاء تفاصيل حول الإعداد LC-MS المستخدمة في هذا البروتوكول لاحقا في الفيديو.
بعد إجراء البحث في قاعدة البيانات والتكامل خطأ الببتيد، حساب منطقة الذروة الشاملة. ثم قارنه بمنحنى معياري خارجي لتقدير تركيز الببتيد في هضم FASP. بعد تقدير كمية الببتيد ، قم بتنقية aliquot جديدة من هضم FASP المقابلة لاثنين من ميكروغرام من الببتيدات من قبل اثنين من تنقية StageTip متتالية كما هو موضح هنا.
يستند إعداد LC-MS المستخدم في هذا البروتوكول إلى الحقن المباشر في العمود التحليلي. إذا كنت تستخدم نظاما يحتوي على عمود تعويض اللون، فيمكنك تجنب خطوة تنقية C18 دون اتصال. تذكر استخدام الإبر والمكابس المخصصة لكل مادة كروماتوغرافية.
بعد التملط الببتيدات من تلميح المرحلة C18 مع 10 ميكرولتر من eluent، تتبخر جزئيا eluate في جهاز طرد مركزي فراغ لبضع دقائق، في محاولة لتجنب التبخر الكامل. ثم، إضافة 47 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪، ووضع الحل الناتج في قارورة HPLC لتحليل LC-MS. يستند النظام المستخدم هنا إلى تحميل عينة عمود مباشرة دون استخدام عمود تعويض اللون.
يتم إجراء الأعمدة التحليلية في المنزل عن طريق سحب الشعرية معرف 75 ميكرومتر بعد إزالة قطعة من طلاء البولي أميد. قد تكون على شكل طرف الناتجة بلطف مع قطع السيراميك. ثم يتم وضع الشعرية في قنبلة التعبئة ومعبأة مع 50 ملليغرام لكل مل الطين isopropanol من C18 ثلاثة ميكرومترات جزيئات المرحلة الثابتة.
هناك حاجة لضغط غاز يتراوح بين 10 و 20 قطعة من النيتروجين أو الهيليوم. يمكنك استخدام أعمدة كروماتوغرافية بديلة أو تجارية تعمل بمعدل تدفق شبه ميكروليتر في الدقيقة. تجميع العمود على قطعة تي.
يتم توصيل طرفي الأخرى إلى إمدادات الطاقة الجهد العالي وحلقة HPLC. تقييم الجهد رذاذ الأمثل عن طريق تشغيل النظام في تدفق isocratic. ثم ابدأ تحليلك.
فصل الببتيدات على مدى ساعتين طويلة تدرج اللوني كما هو معروض. ويتكون الحصول على البيانات من مسح سريع كامل لخدمة التصلب المتعدد يليه 26 مسح MS-MS على نوافذ السلائف ذات العرض المتغير. بدءا من عرض 20 م / ض ، لأول 20 النوافذ التي ستغطي مجموعة م / ض من 350 إلى 750 طومسون.
ثم الانتقال إلى عرض 50 م / ض للنوافذ الخمس التالية وتنتهي مع مسح MS-MS واحد، وجود عرض العزل من 200 طومسون. وتمثل الأطراف ذات الأطراف الأوسع نطاقا منطقة أكثر كثافة سكانية من الطيف من حيث وجود سلائف الببتيد. لتحليل DIA سوف تحتاج إلى مكتبة الطيفية.
لإنشاء مكتبة طيفية، يمكنك إجراء بعض التجارب المعتمدة على البيانات على نفس نظام LC-MS-MS الذي تستخدمه لاكتساب DIA باستخدام نفس تدرج اللوني. سوف زيادة عينة تجزئة تغطية البروتيوم. نصائح المرحلة يمكن استخدامها للكسر عينة.
تبادل cation قوية ومرحلة عكسية أساسية هما بديلان صالحان. تبدأ مع 10 ميكروغرام من مجموعة من هضمات FASP عدة. تحمض العينة باستخدام تركيز نهائي 0.2٪TFA.
تحميل الببتيدات على نصائح المرحلة C18 عالية السعة. استخدام أقراص متعددة في حالة وجود كميات الببتيد عالية. للحصول على 10 ميكروغرام من المواد ، ينصح قرصين.
تنفيذ تنقية C18 كما هو موضح سابقا. إعداد عدة قوارير لجمع eluate. ما يصل إلى عدد الكسور.
في هذه الحالة يتم إنتاج 10 كسور بواسطة الوضوء التدريجي. بعد الغسيل الأخير، أضف 20 ميكرولتر من أول إلونت. 0.2٪ هيدروكسيد الأمونيوم، 10 ملليمولار TEAB، 4٪ أسيتونيتريل.
بعد التمليل الكامل للكسر الأول في Eppendorf الأول ، قم بنقل تلميح المرحلة إلى قارورة التجميع التالية. تمييع في 20 خطوات ميكرولتر باستخدام كما eluent, 0.2٪ من هيدروكسيد الأمونيوم, 10 ملليمولار TEAB, ومن ثم زيادة كمية الأسيتونتريل. بعد تجزئة العينة وتشغيل التجارب التابعة للبيانات على كل كسر، قم بإنشاء مكتبة طيفية بواسطة البحث في قاعدة البيانات لبيانات MS-MS.
ثم سيتم استيراد المكتبة في برنامج قادر على تحليل بيانات DIA للقياس الكمي للبروتين على أساس حد أدنى من الببتيد الفريد المعين من قبل ما لا يقل عن ثلاثة انتقالات. نتوقع لتغطية مجموعة واسعة من البروتيوم البولية. ويبين هذا الرقم تحديد البروتينات وتحديد كميتها عبر نطاق وفرة، يمتد على مدى خمسة أوامر من الحجم.
يجمع سير العمل المعروض هنا بين ميزة التركيز وبراعة بروتوكول FASP مع حساسية وضع المسح DIA. يوفر هذا المزيج خريطة غنية من البروتيوم البولي. منذ إعداد تحليلنا لا يشمل استخدام عمود محاصرة، تم تنقية هضم FASP من قبل كل من تبادل cation قوية وعكس المرحلة نصائح المرحلة.
يمكن حذف خطوة نصائح المرحلة المعكوسة عند توصيل عمود تعويض اللون مباشرة بالعمود التحليلي. ينصح باستخدام سير العمل هذا لتحليل عينات البول EPS ولكن يمكن توسيع استخدامه إلى البروتيوميات البولية بشكل عام.
