O protocolo FASP é uma abordagem interessante para sua proteômica urinária devido à sua compatibilidade com buffers desnaturação fortemente e por causa de sua capacidade de concentrar a amostra no filtro, o que é fundamental para uma amostra de proteína diluída. O protocolo FASP, juntamente com a espectrometria de massa de análise independente de dados, nos permite alcançar uma cobertura proteome profunda em EPS-urina, que é a urina coletada após o exame retal digital. No momento, estamos aplicando o método que você está prestes a ver em um esforço de descoberta de biomarcadores sobre câncer de próstata.
O procedimento será apresentado por Licia Prestagiacomo, Paola Morelli e Caterina Gabriele. Centrifugar amostras de urina EPS dentro de duas horas de coleta por 10 minutos a 2.100 RCF em temperatura ambiente. Em seguida, armazene os supernacantes a menos 80 graus centígrados até usar.
Jogue as amostras no gelo, ou a quatro graus. Para acelerar o procedimento, você pode transferir as amostras de menos 80 para menos 20 no dia anterior à digestão. Como soluções de estoque, você precisará de 500 mililitros DTT, 10% SDS, um amortecedor Tris molar em pH oito.
Diluir 500 microliters de cada amostra de EPS-urina com 67 microliters de SDS, 67 microliters de DTT e 33 microliters de tampão Tris. Incubar a 95 graus centígrados por 10 minutos com agitação suave. Monte a unidade de filtro centrífugo com um corte de peso molecular dalton de 10.000 dalton.
Em seguida, adicione 300 microliters de amostra de EPS-urina diluída ao filtro. Centrifugar a 14.000 g por aproximadamente 20 minutos. Você pode interromper temporariamente o procedimento após 15 minutos ou mais, a fim de verificar se a filtragem está procedendo sem problemas.
Continue até que toda a solução passe pelo filtro. Em seguida, adicione 200 microliters de tampão de ureia e centrífuga a 14.000 g por 15 minutos. Repita este passo uma segunda vez.
Quando o fluxo está prestes a tocar no filtro, esvazie a coleção Eppendorf, pipetando o fluxo-through. Proteínas são seguras no filtro. Para a clolation cisteína, prepare uma solução de iodoacetamida imediatamente antes do uso.
Pesar cerca de 10 miligramas de iodoacetamida em um frasco Eppendorf num número e dissolver-o em tampão de ureia a uma concentração de 9,25 miligramas por ml, ou em termos de molaridade, 50 milimilas. Adicione 50 microliters de solução de iodoacetamida a cada filtro e centrífuga a 6.000 g por 25 minutos. A velocidade de centrifugação inferior permitirá que os filtros não sequem.
Após a alquilação da proteína, lave os filtros com duas alíquotas consecutivas de 200 alíquotas de 200 microliter de tampão de ureia e centrífuga a 14.000 g por 20 minutos. Descarte o fluxo. Adicione 200 microliters de 50 milimolar três tampão de bicarbonato de amônio e centrífuga a 14.000 g por 20 minutos.
Repita este passo. Após completar completamente a última lavagem de bicarbonato, transfira a unidade do filtro para um novo tubo de coleta. Em seguida, adicione 60 microliters de 50 mililitros teab tampão.
Adicione um microliter de solução de trippsina a uma concentração de 200 nanogramas por microliter de trippsina. Alternativamente, você pode preparar o tampão de digestão para todas as amostras em um frasco Eppendorf e distribuir 61 microliters do tampão de digestão para cada filtro. Se estiver usando um ThermoMixer para evitar a evaporação da amostra durante a incubação durante a noite, enrole cada unidade do filtro com uma camada de papel alumínio e, em seguida, uma camada de parafilm.
Incubar as amostras a 37 graus durante a noite. Na manhã seguinte, transfira os filtros para uma centrífuga de bancada para um giro muito curto. Depois de girar, abra as tampas Eppendorf e adicione 140 microliters de água.
Centrifugar os frascos a 14.000 g por 25 minutos, a fim de coletar os peptídeos. O volume coletado deve ser de cerca de 190 microliters. A fim de remover vestígios de SDS do digestão, recomenda-se a forte purificação da troca de cation dos peptídeos antes do LC-MS-MS.
Prepare os suportes de microcólumes perfurando tampas Eppendorf com uma ferramenta afiada como um par de pinças ou tesouras. O suporte acomodará a microcolumn durante a centrifugação. Uma vez que eles são tediosos para se preparar, os titulares podem ser utilizados várias vezes.
Usando uma contundente e uma agulha, remova uma placa do disco de extração apropriado. Discos de extração são materiais poliméricos macios contendo partículas sorbentes. Neste caso, o sorbent é feito de partículas com fortes propriedades de troca de cation.
Acomode a placa em uma ponta de pipeta de 200 microliter. Usando um pistão empurre o plugue para o final da ponta. O pequeno disco deve ser pressionado com firmeza, mas evitando força excessiva.
Insira a ponta no suporte e monte a microcolumna de giro usando um frasco Eppendorf de dois mililitros do qual a tampa original foi removida. O plugue de uma agulha calibre 16 terá uma capacidade de carregamento de cerca de cinco microgramas de peptídeos. Condiciona a microcolumn com duas lavagens consecutivas.
A velocidade apropriada dependerá da força de empurrar o disco para a ponta da pipeta. Objetivo de alcançar uma taxa de fluxo na ordem de 20 a 30 microliters por minuto. Tente não ter a ponta seca durante as lavagens e durante o carregamento da amostra.
Diluir a amostra cinco vezes na solução de lavagem dois e carregar os resultados em solução em velocidade mais lenta. Aponte para uma taxa de fluxo de cerca de 15 a 20 microliters por minuto. Se necessário, descarte o fluxo.
Lave detergentes residuais. Em seguida, deixe o disco secar antes da eluição do peptídeo. Transfira o microcólumn para um tubo eppendorf limpo de 1,5 e adicione imediatamente o eluente.
Que serão sete microliters de uma solução de acetato de amônio de 500 milimônios contendo 20% de acetonitrila. Diluir o elunato com 27 microlitres de ácido fórmico de 0,1% a fim de diminuir a porcentagem de solvente orgânico e, em seguida, injetar dois microliters da solução resultante em LC-MS-MS com detecção no modo dependente de dados. Detalhes sobre a configuração LC-MS usado neste protocolo serão dados mais tarde no vídeo.
Depois de realizar a pesquisa de banco de dados e a integração de erros de peptídeos, calcule a área de pico geral. Em seguida, compare-o com uma curva padrão externa para estimar a concentração de peptídeos no digestor FASP. Depois de estimar a quantidade de peptídeo, purifique uma nova alíquota de digestão FASP correspondente a dois microgramas de peptídeos por duas purificações consecutivas de Ponta de Estágio, conforme descrito aqui.
A configuração LC-MS utilizada neste protocolo é baseada na injeção direta na coluna analítica. Se você estiver usando um sistema com uma coluna de trapping, você pode evitar o passo da purificação C18 offline. Lembre-se de usar agulhas e pistões dedicados para cada material cromatográfico.
Depois de eludir os peptídeos da Ponta de Estágio C18 com 10 microliters de eluent, evaporar parcialmente o elunato em uma centrífuga de vácuo por alguns minutos, tentando evitar a evaporação total. Em seguida, adicione 47 microliters de ácido fórmico de 0,1% e coloque a solução resultante em um frasco HPLC para análise de LC-MS. O sistema utilizado aqui é baseado no carregamento direto da amostra da coluna sem o uso de uma coluna de trapping.
Colunas analíticas são feitas internamente puxando um capilar de 75 micrômetros depois de remover um pedaço de revestimento de poliamida. A ponta resultante pode ser suavemente moldada com um cortador de cerâmica. O capilar é então colocado em uma bomba de embalagem e embalado com um chorume isopropanol de 50 miligramas por ml de partículas de fase estacionária c18 três micromeres.
É necessária uma pressão gasosa entre 10 e 20 barras de nitrogênio ou hélio. Você pode usar colunas de cromatografia alternativa ou comercial em execução a sub microliter por minuto de fluxo. Monte a coluna em um t-piece.
As outras duas extremidades estão conectadas à fonte de alimentação de alta tensão e ao laço HPLC. Avalie a tensão de pulverização ideal executando o sistema em fluxo isocrático. Então, comece sua análise.
Separe os peptídeos com mais de duas horas de gradiente de cromatografia de duas horas de duração, conforme exibido. A aquisição de dados consistirá em uma rápida varredura completa de serviços de MS seguida de 26 varreduras MS-MS em janelas precursoras de largura variável. A partir de 20 m/z de largura, para as primeiras 20 janelas que cobrirão uma faixa m/z de 350 a 750 Thompson.
Em seguida, movendo-se para uma largura de 50 m/z para as cinco janelas seguintes e terminando com uma única varredura MS-MS, tendo uma largura de isolamento de 200 Thompson. Larguras mais estreitas representam uma região mais populosa do espectro em termos de presença de precursores de peptídeos. Para análise do DIA, você precisará de uma biblioteca espectral.
Para gerar uma biblioteca espectral, você pode realizar alguns experimentos dependentes de dados no mesmo sistema LC-MS-MS que você tem usado para aquisição do DIA usando o mesmo gradiente de cromatografia. O fracionamento da amostra aumentará a cobertura proteome. Dicas de estágio podem ser usadas para fracionamento de amostra.
Câmbio forte e fase de reversão básica são duas alternativas válidas. Comece com os 10 microgramas de uma piscina de vários digestores FASP. Acidificar a amostra utilizando concentração final de 0,2%TFA.
Carregue os peptídeos em pontas de estágio C18 de alta capacidade. Use vários discos em caso de altas quantidades de peptídeos. Para 10 microgramas de material, recomenda-se dois discos.
Realize a purificação de C18 conforme descrito anteriormente. Prepare vários frascos para a coleta de eluato. Tanto quanto o número de frações.
Neste caso, 10 frações são produzidas por eluição stepwise. Após a última lavagem, adicione 20 microliters do primeiro eluente. Hidróxido de amônio de 0,2%, 10 mililitros TEAB, 4% de acetonitrilo.
Depois de eludir totalmente a primeira fração no primeiro Eppendorf, mova a Ponta de Palco para o próximo frasco de coleta. Diluir em 20 passos de microliter usando como eluente, 0,2% de hidróxido de amônio, 10 mililitros TEAB e, em seguida, aumento da quantidade de acetonitrila. Depois de fracionar a amostra e executar experimentos dependentes de dados em cada fração, gere sua biblioteca espectral por meio da pesquisa de banco de dados dos dados MS-MS.
A biblioteca será então importada em um software capaz de análise de dados DIA para quantificação de proteínas com base no mínimo de um peptídeo único atribuído por um mínimo de três transições. Espere cobrir uma ampla gama de proteome urinário. Este número mostra a identificação e quantificação de proteínas em uma faixa de abundância, abrangendo cinco ordens de magnitude.
O fluxo de trabalho aqui apresentado combina a vantagem de concentração e a versatilidade do protocolo FASP com a sensibilidade do modo de digitalização dia. Esta combinação fornece um mapa rico do proteome urinário. Como nossa configuração de análise não inclui o uso de uma coluna de trapping, o digesto FASP foi purificado tanto pela forte troca de cation quanto pela fase invertida dicas de estágio.
A etapa de dicas de fase invertida pode ser omitida quando uma coluna de trapping estiver conectada diretamente à coluna analítica. O uso deste fluxo de trabalho é recomendado para analisar amostras de EPS-urina, mas seu uso pode ser estendido para proteômica urinária em geral.
