FASP 协议是尿生殖器的有趣方法，因为它与强变性缓冲器兼容，并且能够将样品集中在过滤器上，而过滤器对于稀释后的蛋白质样本至关重要。FASP 协议与数据独立分析质谱法相结合，使我们能够在 EPS 尿液中实现深质子覆盖，EPS 尿液是在数字直肠检查后收集的尿液。我们目前正在应用您即将在前列腺癌生物标志物发现中看到的方法。
手术将由莉西亚·普雷斯塔贾科莫、保拉·莫雷利和卡特琳娜·加布里埃展示。离心机 EPS 尿样在收集后的两个小时内在室温下 2，100 RCF 收集 10 分钟。然后，将超自然药物存放在零下80摄氏度，直到使用。
把样品扔到冰上，或者四度。为了加快程序，您可以在消化前一天将样品从负 80 转移到负 20。作为库存解决方案，您将需要 500 毫升 DTT、10% SDS、一个 pH8 的摩尔 Tris 缓冲器。
稀释每个 EPS 尿液样本中的 500 微升，其中 67 微升 SDS、67 微升 DTT 和 33 微升 Tris 缓冲器。在95摄氏度的孵化10分钟，轻轻摇晃。用 10，000 道尔顿分子量切断离心滤光单元组装。
然后，在过滤器中加入 300 微升稀释的 EPS 尿液样本。离心机在14，000克约20分钟。您可以在 15 分钟左右后暂时中断手术，以检查过滤是否顺利进行。
继续，直到整个解决方案通过过滤器。然后，在14，000克的尿素缓冲器和离心机中加入200微升，15分钟。第二次重复此步骤。
当流过即将触摸过滤器时，通过管道排出流过来清空收集的 Eppendorf。蛋白质在过滤器上是安全的。对于半胱氨酸烷基化，请在使用前立即准备一个碘乙酰胺溶液。
在Ependorf小瓶中称重约10毫克的碘乙酰胺，并溶解在尿素缓冲中，浓度为每毫升9.25毫克，或用摩尔度术语，50毫摩尔溶解。在每个过滤器中加入 50 微升碘乙酰胺溶液，在 6，000 克的离心机中加入 25 分钟。较低的离心速度将允许过滤器不干。
蛋白质碱化后，用连续两个200微升尿素缓冲液和离心机在14，000克下清洗过滤器20分钟。丢弃流经。在 14，000 克的 14，000 克中加入 200 微升 50 毫升三乙基碳酸氢铵缓冲器和离心机 20 分钟。
重复此步骤。在完全完成最后一次碳酸氢碳酸酯洗涤后，将滤芯单元转移到新的收集管中。然后，加入 60 微升 50 毫升 TEAB 缓冲器。
在每微升试穿素浓度为200纳米的特异素溶液中加入一微升。或者，您还可以为 Eppendorf 小瓶中的所有样品准备消化缓冲，并将消化缓冲液的 61 微升分配到每个过滤器。如果您使用热混合器，以避免在夜间孵化过程中样品蒸发，则用一层铝箔包裹每个滤光单元，然后用一层胶片包裹每个滤光片。
在37度一夜之间孵化样品。第二天早上，将过滤器转移到台式顶部离心机，进行很短的旋转。旋转后，打开埃彭多夫盖，加入140微升水。
将小瓶以14，000克为下心，25分钟，以收集肽。收集的体积应约为 190 微升。为了去除摘要中的 SDS 痕迹，建议在 LC-MS-MS 之前对肽进行强结节交换纯化。
通过用锋利的工具（如一把钳子或剪刀）刺穿 Eppendorf 盖子来准备微孔架。支架将在离心过程中容纳微缩。由于它们准备乏味，持有人可以多次使用。
使用钝针和针头，取出适当提取盘的斑块。提取盘是含有吸收颗粒的软聚合物材料。在这种情况下，果冻是由具有强结化交换特性的粒子制成的。
将斑块放入 200 微升移液器尖端。使用活塞将插头推到尖端。小圆盘应该紧紧推，但要避免过度的强度。
将尖端插入支架，然后使用两毫升 Eppendorf 小瓶组装旋转微胶，从该小瓶中取出原始盖子。仪表16针的插头的装载能力约为5微克肽。用连续两次洗涤来调节微缩。
适当的速度将取决于您将光盘推入移液器尖端的力度。目标是实现每分钟 20 到 30 微升的流速率。尽量不要在洗涤和样品装载过程中使尖端干涸。
将样品稀释五折，在洗涤溶液中二，以较慢的速度将结果加载到溶液中。目标是每分钟约 15 至 20 微升的流量。如果需要，丢弃流经。
洗去残留的洗涤剂。然后，让光盘在肽提取前晾干。将微胶转移到干净的 1.5 埃彭多夫管中，并立即添加 eluent。
这将是含有20%丙酮三酯的500毫升醋酸铵溶液中的7微升。用 27 微升 0.1% 的分酸稀释提升液，以降低有机溶剂的百分比，然后在 LC-MS-MS 中注入两个微升溶液，在数据依赖模式下进行检测。有关本协议中使用的 LC-MS 设置的详细信息，将在稍后的视频中给出。
执行数据库搜索和肽错误集成后，计算总体峰值区域。然后，将其与外部标准曲线进行比较，以估计 FASP 摘要中的肽浓度。在估计肽量后，通过此处描述的连续两个阶段Tip净化，净化与两微克肽相对应的FASP消化液的新别素。
本协议中使用的 LC-MS 设置基于直接注入分析列。如果您使用的系统带有诱捕列，则可以避免离线 C18 净化的步骤。记得使用专用针头和活塞为每个色谱材料。
用10微升的椭圆从C18阶段尖端中提取肽后，在真空离心机中部分蒸发液化几分钟，试图避免完全蒸发。然后，加入 47 微升 0.1% 的分酸，并将由此产生的溶液放在 HPLC 小瓶中，用于 LC-MS 分析。此处使用的系统基于直接基于列样本加载，而不使用陷印柱。
分析柱是内部制作的，在去除一块聚酰胺涂层后，通过拉动 75 微米 ID 毛细管。由此产生的尖端可能用陶瓷切割机轻轻塑造。然后，毛细亚被放入包装炸弹中，并装上每毫升50毫克的C18三微米静止相粒子的异丙丙醇浆。
需要10到20巴氮或氦气压力。您可以使用以每分钟流速低于微升速率运行的替代色谱或商业色谱列。将列组装在 T 件上。
其他两端连接到高压电源和 HPLC 循环。通过在等式流中运行系统来评估最佳喷电压。然后，开始分析。
将肽分离超过两小时长的色谱梯度，如所示。数据采集将包括快速全MS服务扫描，然后对可变宽度的前体窗口进行26次MS-MS扫描。从 20 米/z 宽度开始，前 20 个窗口的覆盖范围从 350 到 750 汤普森。
然后移动到50米/z宽度的以下五个窗口，最后与一个MS-MS扫描结束，隔离宽度为200汤普森。就肽前体的存在而言，较窄的宽度占光谱中人口较多的区域。对于DIA分析，您需要一个光谱库。
为了生成光谱库，您可以使用相同的色谱梯度对使用 DIA 获取的相同 LC-MS-MS 系统进行一些数据依赖实验。样本分馏将增加蛋白体覆盖范围。阶段提示可用于样本分馏。
强大的交流和基本的反向阶段是两种有效的替代方案。从几个 FASP 摘要池的 10 微克开始。使用 0.2% TFA 最终浓度对样品进行酸化。
将肽加载到大容量 C18 阶段提示上。在肽含量高的情况下使用多个光盘。对于 10 微克的材料，建议使用两张光盘。
执行前述C18净化。准备几个小瓶，用于提升收藏。多达分数的数量。
在这种情况下，10个分数是通过分步高卢产生的。上次洗完后，加入20微升的第一个洗涤器。0.2%氢氧化铵，10毫升TEAB，4%甲基三酯。
在完全摆脱了第一个 Eppendorf 的第一个分数后，将舞台提示移动到下一个集合小瓶。稀释在20微升步骤使用作为弹性，0.2%氢氧化铵，10毫升TEAB，然后增加的甲酰胺量。在将样本分馏并按每个分数运行数据依赖实验后，通过对 MS-MS 数据的数据库搜索生成光谱库。
然后，该库将导入一个软件，该软件能够根据至少三个过渡分配的一种独特的肽进行蛋白质定量分析。期望覆盖广泛的泌尿蛋白层。此图显示了蛋白质在丰度范围内的识别和定量，跨越五个数量级。
此处介绍的工作流程将 FASP 协议的集中优势和多功能性与 DIA 扫描模式的灵敏度相结合。这种组合提供了丰富的尿蛋白组地图。由于我们的分析设置不包括使用诱捕列，FASP 摘要通过强 cation 交换和反向阶段提示进行了净化。
当捕获列直接连接到分析列时，可以省略反向阶段阶段提示步骤。建议使用此工作流分析 EPS 尿液样本，但其使用范围一般可扩展到泌尿蛋白质组学。
