단일 분자, 단백질 유발 형광 향상은 단백질 구조 적 하위 인구와 적합성을 연구 할 때 단일 분자 FRET 측정을 칭찬 할 수 있으며, 특히 뚜렷한 구조적 하위 인구가 안정적인 국소 구조에 대해 보고할 때 특히 발생합니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질 표면에 염료 라벨링 부위의 부근을 기반으로 뚜렷한 사이트 별 구조 하위 집단을 포착한다는 것입니다. 단일 분자, 단백질 유도 형광 향상은 뚜렷한, 국소, 구조적 하위 집단을 조사하기 위해 관심있는 모든 생체 분자 시스템에 적용 될 수있다.
먼저 저단단백질 결합 튜브에서 측정 버퍼에서 25피코폴라 Sulfo-Cy3 표지알파 시뉴클레인을 준비한다. 밀리리터 BSA당 1밀리그램의 마이크로리터 100개를 18실 현미경 커버 슬라이드에 넣고 1분 동안 배양한 다음 BSA를 폐기하십시오. 커버 슬립 슬라이드의 챔버에 25 피코폴라 Sulfo-Cy3 라벨 알파 시뉴클레인 샘플의 100 마이크로 리터를 추가합니다.
다음으로, 데이터 수집을 위해, 고숫자 조리개 물 침지 목적 렌즈의 상단에 초순수 한 방울을 추가하고, 스테이지 챔버에 커버 슬립 슬라이드를 고정한 다음 현미경 단계의 상단에 어셈블리를 설치한다. 객관적인 렌즈를 위쪽으로 가져와 서 커버 슬립 슬라이드 의 하단에 있는 객관적인 렌즈 얼룩 위에 물방울을 바르고 레이저 셔터를 엽니다. 객관적인 렌즈가 위쪽으로 움직이면 CCD 카메라의 통풍이 좋은 링 패턴을 검사합니다.
첫 번째 링은 물/유리 인터페이스의 초점을 나타내며, 두 번째 링은 유리와 샘플 용액 사이의 인터페이스에서 초점을 나타냅니다. 목표 렌즈의 높이를 75 마이크로미터로 늘려 커버 슬립의 유리 표면으로부터 의 자가 형광을 최소화하기 위한 용액 깊숙이 레이저 초점을 가져옵니다. 약 100, 마이크로 와트 객관적인 렌즈에서 레이저 전력을 조정합니다.
미리 정의된 시간 동안 감지된 광자의 인수를 시작합니다. Jupyter 노트북을 열고 샘플 노트북을 엽니다. FRETBursts 및 Photon-HDF5 데이터 파일을 로드합니다.
인터포토른 시간의 히스토그램을 사용하여 데이터 수집 의 30초마다 배경 속도를 계산합니다. 20개의 연속 광자용 한 번에 하나의 광자의 시간 창을 이동하고, 즉각적인 광자 속도 F가 데이터 수집 기간 동안 배경 속도보다 11배 이상 큰 경우 광자 데이터를 수집한다. 버스트 크기 및 광자의 배설물, 버스트 지속시간, 버스트 밝기, 버스트 에서 순간 광자 속도의 가장 큰 값, 버스트 분리, 연속 버스트 사이의 시간 간격 사이의 시간 차이를 계산합니다.
이벤트 축을 로그리스믹 스케일로 버스트 밝기 값의 히스토그램을 플롯합니다. 버스트 밝기 임계값을 히스토그램이 부패 패턴을 나타내는 최소 버스트 밝기 값으로 정의하고 버스트 밝기 임계값보다 큰 밝기 값을 가진 버스트를 선택합니다. 버스트 평균 형광 수명 측정의 경우, 광자 수축을 로지반스믹 스케일로 선택한 버스트의 모든 광자에 대한 광자 나노타임의 히스토그램을 플롯한다.
나노시간 임계값을 광나노시간의 히스토그램이 부패 패턴을 나타내는 최소 나노시간 값으로 정의한다. 나노타임 임계값보다 나노타임이 큰 광자만 선택합니다. 선택한 모든 광자 나노타임의 대수 평균을 계산합니다.
광자 나노시간 대수 평균으로부터 나노시간 임계값을 뺍니다. 얻어진 값은 버스트의 평균 광나노시이며, 평균 형광 수명에 직접 비례한다. 모든 버스트 평균 형광 수명의 히스토그램을 플롯합니다.
형광 수명의 중앙 분산 하위 인구가 나타날 수 있습니다. 값이 낮은 평균을 가진 하위 인구는 황색으로 방해되지 않은 Sulfo-Cy3를 가진 분자 종을 나타내고, 더 높은 가치의 평균을 가진 하위 인구는 더 sterically 방해된 S-Cy3를 가진 분자 종을 나타냅니다. 느린 버스트 역학 평가를 위해, 터지는 분리 시간의 히스토그램을 로개리스믹 스케일에서 분리 시간 축으로 플롯합니다.
동일한 분자 하위 모집단을 정의하는 최대 분리 시간 미만으로 분리되는 연속 버스트의 모든 쌍을 저장하려면 선택합니다. 히스토그램 또는 특정 분리 시간 임계값 이하로 되풀이되는 버스트의 모든 쌍에 대해 첫 번째 및 두 번째 버스트의 평균 형광 수명의 분산플롯을 플롯합니다. 단일, S-Cy3 표지, 알파 시뉴클레인-56 분자의 평균 형광 수명의 히스토그램은 첫 번째 하위 집단이 1.6 나노초의 특징적인 형광 수명을 가지고 있음을 보여주었으며, 56년 후 단백질 표면이 거의 없는 알파-synuclein 구성 상태를 나타낸다.
두 번째 하위 인구는 3.5 나노 초의 특징적인 형광 수명을 가지고 있었고 잔류물 56 부근에서 더 많은 단백질 표면을 가진 알파 시뉴클레인 형성 상태를 나타냅니다. 알파-시뉴클레인 분자의 비아밀로이드 베타 성분 세그먼트는 SDS 소포에 결합시 헬리컬, 헤어핀 구조를 채택하는 것으로 알려져 있으며, 이는 약 3나노초의 특징적인 수명을 가진 단일 꽃병 수명 집단으로 확인되었으며, 1.6나노초의 특성수명을 가진 하위 집단의 부재. 연속, 단일 분자 버스트 사이의 분리 시간의 히스토그램은 100 밀리초보다 빠르게 분리 시간에 대한 반복 분자를 보고하며, 여기서 첫 번째와 두 번째 버스트는 동일한 분자에서 발생합니다.
모든 단일 분자 버스트의 평균 형광 수명 히스토그램은 짧은 특성 수명을 가진 하위 인구뿐만 아니라 개별 분자가 버스트 지속 시간보다 느린 다른 평균 수명 값 사이의 전환을 겪을 수 있음을 나타내는 긴 특성 수명을 보였다. 최대 100 밀리초의 파열 분리 시간 안에, 짧은 일생 하위 인구에 있는 첫번째 파열로 시작하고, 긴 일생 하위 인구 내의 두 번째 파열로 재발한 분자의 분수가 있었습니다. 긴 일생 하위 집단에서 첫 번째 버스트로 시작하고, 짧은 일생 인구 내에서 두 번째 파열로 재발한 분자의 분수는 10 에서 100 밀리초 안에 있는 두 하위 집단 사이 전환을 나타냅니다.
실험 결과를 분석할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 배경에서 단일 분자 형광 신호를 적절히 분리하고 충분한 광자 나노타임으로 파열을 분석하는 것입니다. smPIFE의 개발은 연구원이 단일 분자 수준에서 핵산 단백질 상호 작용을 탐구하는 길을 열었습니다. 이 발전은 단백질 내의 현지 구조 역학을 연구하기위한 토대를 마련합니다.
