Одномолекулярное, вызванное белком усиление флуоресценции может дополнять одномолекулярные измерения FRET при изучении структурных субпопуляций и конформаций белка, особенно в тех случаях, когда различные структурные субпопуляции сообщают о стабильных местных структурах. Основным преимуществом этого метода является то, что он захватывает различные структурные субпунции, специфичные для сайта, основанные на близости участка маркировки красителя к поверхностям белка. Одномолекулярное, вызванное белком флуоресцентное усиление может быть применено к любой биомолекулярной системе, представляющим интерес, для исследования различных, локальных, структурных субпопуляций.
Начните с получения 25 пикомоляров сульфо-Cy3-меченого альфа-синуклеина в измерительном буфере в трубке с низким содержанием белка. Добавьте 100 микролитров по одному миллиграмму на миллилитр BSA к слайду крышки 18-камерной микроскопии и высиживайте в течение одной минуты, затем выбросьте BSA. Добавьте 100 микролитров 25 пикомолярных образцов альфа-синуклеина, меченых сульфо-Cy3, в камеру слайда крышки.
Затем для сбора данных добавьте каплю сверхчистой воды на верхнюю часть объектива с высокой числовой диафрагмой, зафиксируйте скользящий слайд крышки в камере сцены, а затем установите узел на верхнюю часть ступени микроскопа. Поднесите объектив вверх до тех пор, пока капля воды сверху объектива не смазывается в нижней части скользящего слайда крышки, и откройте лазерный затвор. Когда объектив сместится вверх, осмотрите рисунок воздушных колец на ПЗС-камере.
Первое кольцо представляет фокус на границе раздела вода/стекло, а второе кольцо представляет фокус на границе раздела между стеклом и раствором образца. Увеличьте высоту объектива на 75 микрометров, чтобы лазерный фокус был глубоко погружен в раствор для минимизации автофлуоресценции от стеклянной поверхности скольжения крышки. Настройте мощность лазера на объективе приблизительно 100 микроватт.
Начните сбор обнаруженных фотонов на заранее определенное время. Откройте записные книжки Jupyter, затем откройте образец записной книжки. Загрузите файл данных FRETBursts и Photon-HDF5.
Используйте гистограмму межфотонного времени для расчета фоновых частот за каждые 30 секунд сбора данных. Переместите временное окно из одного фотона за раз для 20 последовательных фотонов и соберите данные фотонов, если мгновенная частота фотонов F по крайней мере в 11 раз больше фоновой скорости за этот период сбора данных. Рассчитайте размер и количество фотонов в всплеске, продолжительность всплеска, разницу во времени между временем обнаружения последнего и первого фотона в всплеске, яркость всплеска, наибольшее значение мгновенной скорости фотона во всплеске и разделение всплесков, временной интервал между последовательными всплесками.
Построение гистограммы значений яркости серийной очереди с осью событий в логарифмической шкале. Определите порог яркости серийной очереди как минимальное значение яркости всплеска, из которого гистограмма демонстрирует затухающий паттерн, и выберите всплески со значениями яркости, превышающими порог яркости серийной очереди. Для измерения времени жизни средней флуоресценции всплеска построим гистограмму фотонового нановремени для всех фотонов в выбранных всплесках с осью подсчета фотонов в логарифмической шкале.
Определите порог нановрема как минимальное значение нановремени, из которого гистограмма фотоновых нановрейм демонстрирует паттерн распада. Выбирайте только те фотоны, у кого нановремя больше порога нановрем. Рассчитайте алгебраическое среднее всех выбранных фотонов нановремен.
Вычтите порог нановрема из среднего алгебраического значения фотона нановремени. Полученное значение представляет собой среднее фотонное нановремя всплеска, прямо пропорциональное среднему времени жизни флуоресценции. Построй гистограмму всех средних сроков жизни флуоресценции всплеска.
Могут появиться централизованно распределенные субпопуляции времени флуоресценции. Субпопуляции с более низкими средними значениями представляют собой молекулярные виды с Sulfo-Cy3, которые не были стерически затруднены, в то время как субпопуляции с более высокими средними значениями представляют собой молекулярные виды с S-Cy3, которые были более стерически затруднены. Для медленной оценки динамики между всплесками постройте гистограмму времени разделения разрывов с осью времени разделения в логарифмической шкале.
Выберите, чтобы сохранить все пары последовательных всплесков, которые разделены временем, меньшим, чем максимальное время разделения, определяемое субпопуляцию одной и той же молекулы. Постройте гистограмму или диаграмму рассеяния среднего времени жизни флуоресценции первого и второго всплесков для всех пар всплесков, которые повторялись ниже определенного порога времени разделения. Гистограммы среднего времени жизни флуоресценции одной, меченной S-Cy3, молекулы альфа-синуклеина-56 показали, что первая субпопуляция имела характерное время жизни флуоресценции 1,6 наносекунды и представляла собой альфа-синуклеиновые конформационные состояния с небольшим количеством белковых поверхностей в окрестностях остатка 56.
Вторая субпопуляция имела характерное время жизни флуоресценции 3,5 наносекунды и представляла собой альфа-синуклеиновые конформационные состояния с большим количеством белковых поверхностей в окрестностях остатка 56. Известно, что неамилоидные бета-компонентные сегменты молекул альфа-синуклеина принимают спиральную структуру шпильки при связывании с везикулами SDS, что было подтверждено как популяция одного срока жизни флоры с характерным сроком жизни примерно три наносекунды и отсутствием субпопуляции с характерным сроком жизни 1,6 наносекунды. Гистограмма времени разделения между последовательными одномолекулярными всплесками сообщает о повторяющихся молекулах для времени разделения быстрее 100 миллисекунд, где первый и второй всплески возникают из одной и той же молекулы.
Гистограмма среднего времени жизни флуоресценции всех одиночных молекул-всплесков показала субпопуляции с коротким характерным временем жизни, а также с длительным характерным временем жизни, что указывает на то, что отдельные молекулы могут подвергаться переходам между различными средними значениями времени жизни медленнее, чем время продолжительности всплеска. В течение времени разделения всплесков не более 100 миллисекунд была доля молекул, которые начинались как первый всплеск в субпопуляции с коротким сроком службы и повторялись как второй всплеск в субпопуляции с длительным сроком службы. В то время как доля молекул, которая началась как первый всплеск в субпопуляции с длительным сроком службы и повторилась как второй всплеск в популяции с коротким сроком службы, указывает на переходы между двумя субпопуляциями в течение 10-100 миллисекунд.
Самое главное, что нужно помнить при анализе результатов экспериментов, это правильно отделить одномолекулярные флуоресцентные сигналы от фона и проанализировать всплески с достаточным количеством фотон нановрем. Разработка smPIFE проложила путь для исследователей для изучения белковых взаимодействий нуклеиновых кислот на уровне одной молекулы. Это достижение закладывает основу для изучения локальной структурной динамики внутри белков.
