Die proteininduzierte Fluoreszenzverstärkung von Einzelmolekülen kann einzelmolekulare FRET-Messungen ergänzen, wenn proteinstrukturelle Subpopulationen und Konformationen untersucht werden, insbesondere in Fällen, in denen unterschiedliche strukturelle Subpopulationen über stabile lokale Strukturen berichten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie unterschiedliche ortsspezifische strukturelle Subpopulationen erfasst, die auf der Nähe der Farbstoffmarkierungsstelle zu den Proteinoberflächen basieren. Die proteininduzierte Einzelmolekül-Fluoreszenzverstärkung kann auf jedes biomolekulare System von Interesse angewendet werden, um unterschiedliche, lokale, strukturelle Subpopulationen zu untersuchen.
Beginnen Sie mit der Herstellung von 25 Picomolar-Sulfo-Cy3-markiertem alpha-Synuclein im Messpuffer in einem proteinarmen Bindungsröhrchen. Geben Sie 100 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter BSA auf den 18-Kammer-Mikroskopie-Objektträger und inkubieren Sie für eine Minute, dann verwerfen Sie den BSA. 100 Mikroliter 25 Picomolar Sulfo-Cy3-markierte Alpha-Synuclein-Probe in die Kammer des Abdeckschlittens geben.
Als nächstes fügen Sie für die Datenerfassung einen Tropfen Reinstwasser auf die Oberseite der Wasserimmersionslinse mit hoher numerischer Apertur hinzu, befestigen Sie den Abdeckungsschieberschieber in der Bühnenkammer und installieren Sie dann die Baugruppe auf der Oberseite des Mikroskoptisches. Bringen Sie die Objektivlinse nach oben, bis der Wassertropfen oben auf der Objektivlinse an der Unterseite des Abdeckungsrutschens verschmiert, und öffnen Sie den Laserverschluss. Wenn sich das Objektiv nach oben bewegt, untersuchen Sie das Muster der luftigen Ringe auf einer CCD-Kamera.
Der erste Ring stellt den Fokus an der Wasser/Glas-Grenzfläche dar, und der zweite Ring stellt den Fokus an der Grenzfläche zwischen dem Glas und der Probenlösung dar. Erhöhen Sie die Höhe der Objektivlinse um 75 Mikrometer, um den Laserfokus tief in die Lösung zu bringen, um die Autofluoreszenz von der Glasoberfläche des Deckschlupfes zu minimieren. Stellen Sie die Laserleistung an der Objektivlinse auf ca. 100 Mikrowatt ein.
Starten Sie die Erfassung der detektierten Photonen für eine vordefinierte Zeit. Öffnen Sie die Jupyter Notebooks, und öffnen Sie dann das Beispielnotizbuch. Laden Sie die FRETBursts- und Photon-HDF5-Datendatei.
Verwenden Sie das Histogramm der Interphotonenzeiten, um die Hintergrundraten für alle 30 Sekunden der Datenerfassung zu berechnen. Verschieben Sie ein Zeitfenster von jeweils einem Photon für 20 aufeinanderfolgende Photonen und sammeln Sie die Photonendaten, wenn die momentane Photonenrate F mindestens 11-mal größer ist als die Hintergrundrate für diesen Zeitraum der Datenerfassung. Berechnen Sie die Burstgröße und die Menge der Photonen in einem Burst, die Burstdauer, die Zeitdifferenz zwischen der letzten und der ersten Photonendetektionszeit in einem Burst, die Bursthelligkeit, den größten Wert der momentanen Photonenrate in einem Burst und die Burst-Trennung, das Zeitintervall zwischen aufeinanderfolgenden Bursts.
Zeichnen Sie das Histogramm der Bursthelligkeitswerte mit der Ereignisachse in einer logarithmischen Skala. Definieren Sie den Bursthelligkeitsschwellenwert als den minimalen Bursthelligkeitswert, ab dem das Histogramm ein abklingendes Muster aufweist, und wählen Sie die Bursts mit Helligkeitswerten aus, die größer als der Bursthelligkeitsschwellenwert sind. Für die Messung der mittleren Fluoreszenzlebensdauer des Bursts zeichnen Sie das Histogramm der Photonennanozeit für alle Photonen in den ausgewählten Bursts mit der Photonenzählachse in einer logarithmischen Skala auf.
Definieren Sie den Nanozeitschwellenwert als den minimalen Nanozeitwert, ab dem das Histogramm der Photonennanozeiten ein zerfallendes Muster aufweist. Wählen Sie nur die Photonen aus, deren Nanozeit größer als der Nanozeitschwellenwert ist. Berechnen Sie den algebraischen Durchschnitt aller ausgewählten Photonen-Nanozeiten.
Subtrahieren Sie den Nanozeitschwellenwert vom algebraischen Mittelwert der Photonennanozeit. Der erhaltene Wert ist die mittlere Photonen-Nanozeit des Bursts, direkt proportional zur mittleren Fluoreszenzlebensdauer. Zeichnen Sie das Histogramm aller geplatzten mittleren Fluoreszenzlebensdauern auf.
Die zentral verteilten Subpopulationen der Fluoreszenzlebensdauer können auftreten. Die Subpopulationen mit niedrigwertigen Durchschnittswerten repräsentieren die molekularen Spezies mit Sulfo-Cy3, die nicht sterisch behindert wurden, während die Subpopulationen mit höherwertigen Durchschnittswerten die Molekülspezies mit S-Cy3 darstellen, die sterisch stärker behindert waren. Für die langsame Bewertung der Dynamik zwischen den Bursts zeichnen Sie das Histogramm der Burst-Trennzeiten mit einer Separationszeitachse in einer logarithmischen Skala auf.
Wählen Sie diese Option aus, um alle Paare der aufeinanderfolgenden Bursts zu speichern, die durch weniger als eine maximale Trennzeit getrennt sind, die die Subpopulation desselben Moleküls definiert. Zeichnen Sie ein Histogramm oder ein Streudiagramm der mittleren Fluoreszenzlebensdauer des ersten und zweiten Bursts für alle Paare der Bursts auf, die unterhalb einer bestimmten Trennzeitschwelle aufgetreten sind. Die Histogramme der mittleren Fluoreszenzlebensdauer eines einzelnen, S-Cy3-markierten Alpha-Synuclein-56-Moleküls zeigten, dass die erste Subpopulation eine charakteristische Fluoreszenzlebensdauer von 1,6 Nanosekunden aufwies und Alpha-Synuclein-Konformationszustände mit wenigen Proteinoberflächen in der Nähe von Rest 56 darstellte.
Die zweite Subpopulation hatte eine charakteristische Fluoreszenzlebensdauer von 3,5 Nanosekunden und repräsentierte Alpha-Synuclein-Konformationszustände mit mehr Proteinoberflächen in der Nähe von Rest 56. Es ist bekannt, dass die Nicht-Amyloid-Beta-Komponentensegmente von Alpha-Synuclein-Molekülen bei der Bindung an SDS-Vesikel eine helikale Haarnadelstruktur annehmen, die als einzelne Blütenstandslebenspopulation mit einer charakteristischen Lebensdauer von etwa drei Nanosekunden und abwesenheit der Subpopulation mit der charakteristischen Lebensdauer von 1,6 Nanosekunden bestätigt wurde. Das Histogramm der Trennzeiten zwischen aufeinanderfolgenden Einzelmolekül-Bursts meldet wiederkehrende Moleküle für die Trennungszeiten schneller als 100 Millisekunden, wobei der erste und der zweite Burst aus demselben Molekül entstehen.
Das mittlere Fluoreszenzlebensdauerhistogramm aller einzelnen Molekülausbrüche zeigte Subpopulationen mit einer kurzen charakteristischen Lebensdauer sowie mit einer langen charakteristischen Lebensdauer, was darauf hindeutet, dass einzelne Moleküle Übergänge zwischen verschiedenen durchschnittlichen Lebensdauerwerten langsamer durchlaufen könnten als burst-Dauerzeiten. Innerhalb von Burst-Trennzeiten von höchstens 100 Millisekunden gab es einen Bruchteil von Molekülen, die als erster Burst in der kurzlebigen Subpopulation begannen und als zweiter Burst innerhalb der langlebigen Subpopulation wiederholten. Während der Anteil der Moleküle, die als erster Burst in der langlebigen Subpopulation begannen und als zweiter Burst innerhalb der kurzlebigen Population wieder auftraten, die Übergänge zwischen den beiden Subpopulationen innerhalb von 10 bis 100 Millisekunden anzeigt.
Das Wichtigste, woran man sich bei der Analyse der experimentellen Ergebnisse erinnern sollte, ist, Einzelmolekül-Fluoreszenzsignale richtig vom Hintergrund zu trennen und Bursts mit genügend Photonen-Nanozeiten zu analysieren. Die Entwicklung von smPIFE ebnete den Forschern den Weg, Nukleinsäureprotein-Wechselwirkungen auf Einzelmolekülebene zu erforschen. Dieser Fortschritt legt den Grundstein für die Untersuchung der lokalen Strukturdynamik in Proteinen.
