هذا البروتوكول مهم لأنه يوفر الإجراء الكامل لإنشاء قطرات من فيلم الدهون إلى محلول الدهون إلى الفقاعات الدقيقة ومن ثم إلى قطرات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي بساطة تكثيف الفقاعات الصغيرة إلى قطرات. فقط عن طريق التبريد والدوامات ، يمكن إجراء قطرات دون الحاجة إلى الضغط.
مظاهرة بصرية أمر بالغ الأهمية لأن اختبارا بسيطا لمعرفة ما إذا كان قد تم تكثيف الفقاعات الصغيرة بنجاح هو عن طريق التحقق بصريا من التغيير في الشفافية. وسوف يظهر هذا الاجراء كيمون يو وهو طالب ماجستير فى معمل قانغ تشنغ . باستخدام ديكابر، وإزالة ختم الألومنيوم على قارورة المصل ونقل ملليلتر واحد من محلول الدهون إلى 1.85 ملليلتر بوروسيليكاتي زجاج عينة قارورة مع غطاء المسمار الفينول عن طريق السماح للحل الدهون تتدفق أسفل الجدار الداخلي دون خلق فقاعات.
مع قارورة عينة 1.85 ملليلتر الاستعداد لتدفق في غاز ديكافلوروبوتان في مساحة رأس القارورة عينة باستخدام مبادل الغاز. تأكد من إغلاق جميع الصمامات الموجودة على مبادل الغاز بشكل صحيح وإيقاف تشغيل المضخة. فتح صمام متعددة وفك بعناية الإبرة المقابلة من متعددة.
صمام الضغط المفتوح A وصمام الضغط B وتحويل صمام اسطوانة الغاز تقريبا 1/16 إلى 1/8 عكس اتجاه عقارب الساعة لفتحه جزئيا. افتح صمام مقبض T ولم يتم تحديد قارورة العينة بمحلول الدهون. ضع الإبرة المتعددة فوق واجهة الهواء السائلة للقارورة ، ثم قم بتشغيل صمام تنظيم الهواء ببطء في اتجاه عقارب الساعة حتى تتحرك إبرة قياس منظم الهواء قليلا من موضع الراحة والسماح لغاز البيرفلوروكربون بالتدفق بلطف إلى مساحة رأس القارورة لمدة 30 ثانية ، مع الحرص على عدم إنشاء فقاعات.
ضبط صمام منظم الهواء إذا لزم الأمر. بعد 30 ثانية، أبقى بعناية وبسرعة قارورة العينة دون تحريك القارورة أكثر من اللازم. كل من صمام اسطوانة الغاز، صمام مقبض T، صمام تنظيم الهواء، صمام الضغط A، صمام الضغط B، وصمام متعدد.
غمد بعناية الإبرة، ثم وصفت قارورة العينة وختم الرقبة مع فيلم الشمع تسير في اتجاه عقارب الساعة. تخزين قارورة عينة في الظلام وعلى أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل أو ما يصل إلى 24 ساعة. ضع حوالي 100 غرام من الثلج الجاف في حاوية معزولة في مكان الجليد العادي في حاوية معزولة أخرى.
استرداد قارورة مصل ديكافلوروبوتان المعدة سابقا إلى 1.5 بوصة 20 إبر قياس, حقنة بلاستيكية ملليلتر واحد, حاوية 200 ملليلتر, ملقط معدني, وميزان الحرارة. ضع القارورة عينة مع محلول الدهون في المحرض الميكانيكية والتحريض لمدة 45 ثانية. يجب أن يكون هناك تغيير في اللون والزوال.
بعد الهياج الميكانيكي، والوقوف على الجانب الأيمن قارورة عينة محمية من الضوء وبدء العد التنازلي لمدة 15 دقيقة لتهدئة القارورة وحجم حدد microbubbles. عندما يصل العد التنازلي إلى 10 دقائق، املأ حاوية بحوالي 200 ملليلتر من الأيزوبروبانول وبردها إلى ناقص 20 درجة مئوية مع الثلج الجاف باستخدام ملقط معدني. بعد أن تم اختيار الفقاعات الصغيرة لمدة 15 دقيقة ، ابحث عن القسم المحدد للحجم داخل قارورة العينة.
الحفاظ على عينة قارورة الجانب الأيمن لأعلى، بعناية uncapped قارورة العينة وسحب حوالي 0.7 ملليلتر من القسم السفلي مع إبرة قياس 1.5 بوصة 20 تعلق على حقنة بلاستيكية ملليلتر واحد. تأكد من عدم سحب أي من القسم العلوي وعدم نفض الغبار الحقنة لإزالة جيوب الهواء. تهدف إلى الدائرة الوسطى على سدادة المطاط، إدراج إبرة قياس مختلفة 20 في قارورة مصل ديكافلوروبوتان مع الحفاظ على الإبرة بالقرب من الجزء العلوي من قارورة المصل للتنفيس ومن ثم إدراج الإبرة مع حجم microbubbles مختارة.
نقل ببطء حجم الفقاعات الصغيرة المحددة. دع السائل ينزلق برفق إلى أسفل الجدار الداخلي لقارورة مصل ديكافلوروبوتان. مرة واحدة تم نقل كل حجم محلول microbubble مختارة، وإزالة الإبرة مع الحقنة، ولكن الحفاظ على إبرة التنفيس في لتخفيف الضغط السلبي.
إضافة كميات صغيرة من الجليد الجاف أو درجة حرارة الغرفة isopropanol إلى حمام ايزوبروبانول لضمان درجة حرارة الحمام بين ناقص 15 إلى ناقص 17 درجة مئوية. مع إبرة تنفيس قياس 20 إدراجها بالقرب من الجزء العلوي من قارورة المصل، ووضع قارورة المصل وحمام ايزوبروبانول، والحفاظ على مستوى microbubble تحت مستوى ايزوبروبانول، ولكن الرقبة قارورة فوقه وتدور بشكل متقطع قارورة المصل لمدة دقيقتين لتكثيف microbubbles. لا تدور قارورة المصل باستمرار في ايزوبروبانول ولا تدع الحل تجميد.
دوامة لمدة خمس ثوان ورفع قارورة المصل من الايزوبروبانول. تحقق من وجود نواة الجليد، ثم استئناف دوامة في ايزوبروبانول. إذا كان هناك تشكيل الجليد، دوامة قارورة المصل في الهواء حتى يتبدد.
بعد التكثيف دقيقتين إزالة قارورة المصل من حمام ايزوبروبانول وإزالة إبرة التنفيس. كان ينبغي أن تتكثف الفقاعات الصغيرة إلى قطرات كما هو مبين من خلال التغير في الشفافية. مسح قارورة المصل، وتسميتها، ووضعها على الجليد العادية في حاوية معزولة الظلام حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
يجب أن تكون القطرات غير المفتوحة ذات ختم الألومنيوم السليم مستقرة لمدة تصل إلى ست ساعات طالما يتم استبدال الجليد الذائب حسب الحاجة. عندما تكون جاهزة للاستخدام، وإزالة ختم الألومنيوم مع decapper. بعد استخدام هذا البروتوكول ، تم قياس الفقاعات الدقيقة المحددة مسبقا والحجم وقطرات ما بعد المكثف على عداد كولتر مع فتحة 10 ميكرون.
تظهر بيانات التحجيم لصياغة البيرو-الدهون بنسبة 30٪. تظهر الإحصائيات المستندة إلى بيانات التحجيم هنا. باستخدام نسبة من أقطار المتوسط قبل وبعد المكثف، أظهرت النتائج أنه مع زيادة محتوى الدهون البيرو، انخفض التركيز، وزاد متوسط القطر.
يظهر الممثل قياسات ماصة لعينة قطرات البيرو-الدهون بنسبة 30٪. وأظهر ذلك أن التجميعات السليمة لها خصائص بصرية مختلفة كما تعكسها ذروة مختلفة مقارنة بالمكونات الفردية غير المجمعة للدهون. تظهر هنا قياسات الفلورسينس التمثيلية لعينة القطرات المجهرية المكثفة قبل المكثفة مع 30٪ من الدهون البيرو، مما يدل على قمم مضان مختلفة للعينات السليمة في الشكل المعطل.
تظهر صور تمثيلية بالموجات فوق الصوتية لعينة قطرات البيرو-الدهون بنسبة 30٪ المصورة بضغوط مختلفة. في الضغوط المنخفضة ، لوحظت فقط إشارة خلفية من فقاعات الهواء العالقة من توليف أجار. في قوة أعلى قليلا، تم إنشاء عدد قليل من الفقاعات الصغيرة، وهو ما يتضح من ظهور بقع ساطعة.
تم توليد المزيد من الفقاعات الصغيرة مع زيادة الضغط. من المهم أن نتذكر أن درجة حرارة التكثيف هنا هو الأمثل لهذه الصياغة قذيفة قطرة محددة. قد تتطلب تركيبات الصدف المختلفة درجة حرارة مختلفة.
