يصف هذا البروتوكول نظام التعتيم الكيميائي للحث على مكثفات البروتين على التيلوميرات. يمكن تكييفها بسهولة للحث على المكثفات على loci الجينوم الأخرى ، ومناسبة للتحقيق في تشكيل ووظيفة المكثفات المرتبطة الكروماتين. توفر هذه الطريقة الدقة الزمنية اللازمة لتصوير الخلايا الحية وتحافظ على فصل المرحلة في مجموعة الخلايا لإجراء المقاييس الكيميائية الحيوية.
للبدء، حل الخافضات في DMSO في 10 ملليمولار وتخزينها في أنابيب الطرد المركزي البلاستيكية في ناقص 80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. تمييع aliquot من 10 ملليمتر ملليمتر في متوسط التصوير إلى تركيز المخزون من 10 ميكرومولار وتخزينه في ناقص 20 درجة مئوية. عندما تكون جاهزة للاستخدام، تمييع الخافقات إلى تركيز العمل النهائي من 100 نانومولار في متوسط النمو أو وسيلة التصوير.
البذور 10 إلى الخلايا الخامسة في نظارات غطاء دائري قطرها 12 ملليمتر المغلفة بولي مد ليسين في لوحة من ستة آبار. ثم قم بإعادة إصابة الخلايا بلازميدات هالو-GFP-TRF1 و mCherry-eDHFR-SIM أو mCherry-eDFR-SIM المتحولة وانتظر لمدة 24 إلى 48 ساعة قبل الشروع في الفلورسينسية المناعية. أضف 100 جهاز ديميرلار نانومولار مخفف إلى الخلايا واحتضنها في 37 درجة مئوية لمدة أربع إلى خمس ساعات.
بعد الحضانة، قم بإصلاح الخلايا في محلول PBS الذي يحتوي على 4٪ فورمالديهايد و0.1٪ تريتون X-100 لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لبيرمابيليز الخلايا. ثم غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. ينزلق غطاء الغسيل مرتين مع 50 ميكرولتر من TBS-Tx ومرة واحدة مع 50 ميكرولتر من العازلة لتخفيف الأجسام المضادة.
احتضان كل زلة غطاء مع 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة PML الأولية، المضادة للسومو-1، أو المضادة سومو-2 و 3 الأجسام المضادة في أربع درجات مئوية في غرفة رطبة بين عشية وضحاها. ينزلق غطاء الغسيل ثلاث مرات مع عازل تخفيف الأجسام المضادة لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير المقيدة ، ثم احتضان الخلايا بأجسام مضادة ثانوية لمدة ساعة واحدة في صندوق مظلم في درجة حرارة الغرفة. بعد تلطيخ، يغسل الغطاء ينزلق ثلاث مرات مع TBS-TX.
الشرائح التسمية عن طريق إضافة اثنين من ميكرولتر واحد ميكروغرام لكل ملليلتر DAPI، ثم الوجه الغطاء ينزلق أكثر ووضعها على إسقاط DAPI. يستنشق السوائل الزائدة من حافة زلة الغطاء. ختم الشريحة مع طلاء الأظافر، والسماح لها لتجف، وشطف الجزء العلوي من زلة الغطاء بالماء.
ضع الشرائح في الثلاجة حتى التصوير. البذور 10 إلى الخلايا الخامسة على نظارات تغطية دائرية 12 ملليمتر المغلفة بولي-D-Lysine في لوحة من ستة آبار وtransfect لهم مع هالو-TRF1 و mCherry-eDHFR-SIM أو mCherry-eDHFR-SIM plasmids متحولة. إصلاح الخلايا مع 4٪ الفورمالديهايد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وغسلها أربع مرات مع برنامج تلفزيوني.
لIF-FISH، وصمة عار الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية وإعادة تثبيتها مع 4٪ الفورمالديهايد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم غسلها أربع مرات مع برنامج تلفزيوني وتجفيف زلات الغطاء في سلسلة الإيثانول. احتضان زلات الغطاء مع 488 التيلومير C-PNA التحقيق في خمسة ميكرولتر من محلول التهجين في 75 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، ثم احتضان الغطاء ينزلق بين عشية وضحاها في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة. يغسل الغطاء ثلاث مرات مع عازلة غسل لمدة دقيقتين لكل غسل في درجة حرارة الغرفة وجبل لهم مع ميكروغرام واحد لكل ملليلتر DAPI في وسائل الإعلام المتصاعدة للتصوير.
للتصوير الحي، قم بتركيب الغطاء في غرف مغناطيسية على مرحلة ساخنة في غرفة بيئية، مع الحفاظ على الخلايا في ملليلتر واحد من وسيط التصوير دون اللون الأحمر الفينول. إعداد المجهر وجهاز مراقبة البيئة كما هو موضح في المخطوطة النصية. تحديد موقع الخلايا مع إشارة GFP مشرق على التيلوميرات ونشر إشارة mCherry في السيتوسول.
العثور على حوالي 20 خلية، وحفظ كل موقف مع معلومات XYZ، وإعداد المعلمات للتصوير الفاصل الزمني. استخدم تباعد 0.5 ميكرومتر لما مجموعه ثمانية ميكرومترات في Z وفترة زمنية مدتها خمس دقائق لمدة ساعتين إلى أربع ساعات لكل من قنوات GFP و mCherry. استخدام 30٪ من 594 نانومتر و 50٪ من كثافة الطاقة نانومتر 488، مع أوقات التعرض من 200 مللي ثانية وكسب الكاميرا من 300.
بدء التصوير واتخاذ حلقة زمنية واحدة كما قبل التعتيم. ثم وقف التصوير مؤقتا، إضافة 0.5 ملليلتر من وسائل الإعلام التصوير التي تحتوي على 15 ميكرولتر من 10 ميكرومولار ديميريزر إلى غرفة التصوير، مع الحرص على عدم لمس المرحلة، واستئناف التصوير. عندما تكون جاهزة لعكس التعتيم، وقفة التصوير وإضافة 0.5 ملليلتر من وسائط التصوير التي تحتوي على اثنين من ميكرولتر من 100 ملليمولار TMP الأسهم إلى غرفة التصوير.
استمر في تصوير الخلايا لمدة ساعة إلى ساعتين. للتصوير الثابت، استخدم إعداد المجهر نفسه مثل التصوير الحي، ولكن بدون تسخين المرحلة. حدد موقع حوالي 30 إلى 50 خلية مع الإشارة الحمراء لتحديد الخلايا المصابة.
الحصول على الصور مع تباعد 0.3 ميكرومتر لما مجموعه ثمانية ميكرومتر في Z.Use 80٪ من 647 نانومتر، 80٪ من 561 نانومتر، و 70٪ من كثافة الطاقة نانومتر 488، مع أوقات التعرض من 600 مللي ثانية وكسب الكاميرا من 300. تم تحديد توطين السومو بالتلوميريك باستخدام حمض التيلومير DNA FISH والفلورة المناعية لبروتين سومو. الخلايا مع SIM تجنيد المخصب SUMO-1 و SUMO-2 و 3 مقارنة مع الخلايا مع تجنيد متحولة SIM، مما يشير إلى أن SIM التعتيم الناجم عن إثراء السومو على التيلوميرات يعتمد على التفاعلات بين السومو SIM.
يتم عرض فيلم الفاصل الزمني من TRF-1 وSIM بعد التعتيم هنا. تم توظيف SIM بنجاح إلى التيلوميرات ، وأصبح كل من SIM و TRF-1 بؤر أكبر وأكثر إشراقا ، كما هو متوقع لتشكيل قطرة السائل والنمو. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ انصهار بؤر TRF-1، مما أدى إلى تجمع التيلومير، كما هو مبين في انخفاض عدد التيلومير وزيادة كثافة التيلومير مع مرور الوقت.
وعلى النقيض من ذلك، تم تجنيد متحولة SIM إلى التيلوميرات بعد التعتيم، ولكنها لم تحفز أي تشكيل قطرة أو تجمع التيلومير، مما يشير إلى أن فصل المرحلة وتتجمع التيلومير مدفوع بتفاعلات SUMO-SIM. ولوحظ عكس فصل المرحلة وتتجمع التيلومير بعد إضافة فائض TMP الحرة. ارتفع عدد التيلومير وانخفضت كثافة التيلومير مع مرور الوقت.
يتم عرض الصور التمثيلية ل APBs التي تم تحديدها بواسطة التيلومير DNA FISH وبروتين PML إذا هنا. الخلايا مع SIM تجنيدها لديها APBs أكثر من الخلايا مع متحولة SIM تجنيدها، مما يشير إلى المكثفات الناجمة عن التعتيم هي في الواقع APBs. عند تنفيذ هذا البروتوكول، لا تعرض أجهزة التعتيم الحساسة للضوء للضوء.
العمل في غرفة مظلمة مع مصباح التي تنبعث منها الضوء الأحمر والتفاف الخلايا مع رقائق الألومنيوم أثناء الحضانة. بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام وضع العلامات عن قرب لإنشاء قائمة شاملة من المكونات في المكثفات المستحثة. يمكن استخدام التصوير الحي لمتابعة ديناميكيات المكونات في المكثفات.
يمكن أن تساعد هذه الطرق في تحديد أدوار التحكم في تكوين المكثفات.
