يسهل هذا البروتوكول فحص التركيبات الجديدة لفهم أفضل لكيفية تأثير التعديلات على أوقات إقامة الأنسجة ، وهو أمر بالغ الأهمية في تصميم نظام مثالي لتوصيل الأدوية. هذه التقنية غير جراحية وتسمح بالتصوير في الوقت الفعلي ، مما يقلل من الاستخدام المفرط للحيوانات لأخذ العينات. يمكن إعادة تصميم أنظمة توصيل الأدوية للتصوير والتطبيقات العلاجية ببساطة عن طريق تضمين الدواء العلاجي والتصوير التصويري في ناقل نانو واحد.
هذا له تطبيقات مفيدة في كل من علاج السرطان والأمراض المعدية. ستعرض الإجراء رشا مسلم ، وهي زميلة أبحاث أقدم من مختبري. بادئ ذي بدء ، قبل ساعتين من الحقن تحت الملتحمة ، حقن الفأر عن طريق الوريد عن طريق الذيل مع 2.5 ملليغرام لكل كيلوغرام من إيفانز الأزرق ، أو EB. بعد تخدير الماوس بنسبة 5٪ isoflurane ، انقل الماوس إلى مخروط الأنف وحافظ على الماوس المهدئ على وسادة التدفئة.
ثم ، قم بتقليم الشعيرات بالقرب من العين المراد حقنها. غرس قطرة من 0.5 ٪ محلول هيدروكلوريد proxymetacaine مباشرة على العين. بعد ذلك ، قم بتحميل حقنة زجاجية 10 ميكرولتر مجهزة بإبرة قياس 32 مع الجسيمات الشحمية الفلورية وتأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في المحقنة.
باستخدام ملاقط ، ارفع الملتحمة وحقن الجسيمات الشحمية ببطء في الفضاء تحت الملتحمة ، ثم اسحب الإبرة ببطء ، مما يمنع التدفق الخلفي. تأكد من تكوين بليب مملوء بالجسيمات الشحمية الفلورية. قم بإعطاء قطرة حمض fusitic بنسبة 1٪ على العين وراقب الفأر حتى يستعيد وعيه.
قم بتشغيل نظام CLM. قم بتوصيل المسبار بنظام CLM. اختر مجال العرض وموقع ملفات الاستحواذ في هذه المرحلة.
اضبط شدة الليزر للتأكد من أن الكشف عن التألق للفلوريسين DHPE في النطاق الخطي ، والحفاظ على الكثافة متسقة للمقارنة بين الصور الملتقطة في نقاط زمنية مختلفة. بعد تسخين النظام لمدة 15 دقيقة، قم بمعايرة النظام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة باستخدام مجموعة المعايرة التي تحتوي على محاليل التطهير والشطف والفلورو-4 لكل ليزر. باختصار ، ابدأ في المعايرة عن طريق غمر الطرف لمدة خمس ثوان في كل قارورة التطهير ، ثم في قارورة الشطف.
اترك الطرف في الهواء لتسجيل الخلفية لتطبيع قيم الخلفية من المجسات الألياف المختلفة ، مما يضمن توحيد الصورة. مرة أخرى ، اغمر الطرف لمدة خمس ثوان في قارورة التطهير ، ثم في قارورة الشطف. بعد ذلك ، اغمر الطرف في القارورة التي تحتوي على الفلورو-4 488-نانومتر لمدة خمس ثوان لتطبيع قيم الإشارة.
كرر غمر الطرف لمدة خمس ثوان في قارورة التنظيف متبوعة بقارورة الشطف. احتفظ بالطرف في قارورة الشطف حتى تختفي إشارة التألق المسجلة في الخطوة السابقة. ثم انقل الطرف الموجود في القارورة التي تحتوي على الفلورو-4 660 نانومتر لتطبيع قيم الإشارة من الألياف المختلفة في المسبار.
بعد المعايرة، تأكد من أن القيمة أقل من 100 لخلفية المسبار. خلاف ذلك ، قم بإجراء التنظيف المتكرر للمسبار باستخدام قضيب طرف قطني. قم بتشغيل وحدة التحكم في درجة حرارة الحيوان باستخدام وسادة تسخين مرفقة ، واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية.
بعد تغطية وسادة التدفئة بستارة جراحية ، قم بإصلاح مخروط الأنف على وسادة التدفئة. بعد تخدير الماوس باستخدام 5٪ isoflurane في غرفة الحث ، انقل الماوس إلى مخروط الأنف وحافظ على الماوس المخدر على لوحة تسخين. ثم ، غرس قطرة من مخدر 0.5 ٪ محلول هيدروكلوريد proxymetacaine على العين.
لغسل سطح العين وتجنب تبلور العدسة ، حافظ على تشحيم العينين عن طريق إسقاط بضع قطرات مالحة. بعد ذلك ، قم بتدوير وضبط عدسة المجهر لعرض عين الماوس بشكل مريح في التركيز المباشر عند تكبير 0.67 مرة. قم بتشغيل الليزر ووضع المسبار مثل القلم مباشرة على منطقة العين المراد تصويرها.
بعد ذلك ، ابدأ في تسجيل الاستحواذ لمراقبة التألق في العين في المنطقة موضع الاهتمام. أوقف التسجيل عندما يتم وضع علامة على جميع المناطق وتصنيفها وفقا لخريطة العين لمعرفة موقع المسبار الدقيق في الإطار الدقيق. سيتم حفظ ملفات الاستحواذ تلقائيا كملفات فيديو في الموقع الذي تم اختياره مسبقا.
كشف التصوير الفلوري عن تمايز واضح بين منطقتي الصلبة والقرنية. تسبب ارتفاع الأوعية الدموية في episclera والملتحمة في تلطيخ منطقة الصلبة باللون الأحمر مع EB. القرنية ، التي تفتقر إلى الأوعية الدموية ، بدت سوداء. لوحظ التباين الفلوري للعضلي والصلبة في دراسة استمرت سبعة أيام.
أكدت الفئران الضابطة المحقونة بصبغة الفلوريسين خصوصية التألق المشتق من الجسيمات الشحمية. كانت كثافة التألق عالية في اليومين الأول والثالث. أدى التألق الأخضر إلى تقليل الجسيمات الشحمية في منطقتي العضل والصلبة مع مرور الوقت.
لم تكن الاختلافات في إشارات التألق من اليوم الأول إلى اليوم الثالث بعد الحقن في مناطق الأطراف الصدغية والأطراف العليا كبيرة ، مما يشير إلى تفضيل الجسيمات الشحمية المحايدة على منطقة النسيم ، وخاصة محيط القرنية. بالنسبة للمناطق الصدغية والمتفوقة في اليوم الأول بعد الحقن ، كان التألق في الصلبة أعلى بست مرات منه في الأطراف. بحلول اليوم الثالث والسابع ، انخفضت الجسيمات الشحمية بشكل كبير في الصلبة في المناطق الزمنية والمتفوقة ، ويعزى ذلك إلى آليات إزالة العين.
تم الكشف عن أقل كمية من التألق في المناطق الأنفية والسفلية ، بسبب المسافة من موقع الحقن. من المهم تسمية إطارات البقع وفقا لخريطة العين قبل إيقاف التسجيل. حافظ على اتساق شدة الليزر، وحدد الحد الأقصى لقيمة الخلفية للمقارنة المناسبة عبر التجارب المختلفة.
بعد تحديد تركيبات الرصاص ، يمكن إجراء دراسات شاملة للحركية الدوائية والتوزيع الحيوي على الحيوانات لدراسة التوافر البيولوجي للدواء ، والتحقق من الفعالية العلاجية لتركيباتها.
