Este protocolo facilita la detección de nuevas formulaciones para comprender mejor cómo las modificaciones afectan sus tiempos de residencia en los tejidos, lo cual es fundamental para diseñar un sistema óptimo de administración de fármacos. Esta técnica no es invasiva y permite la obtención de imágenes en tiempo real, lo que reduce el uso excesivo de animales para el muestreo. Los sistemas de administración de fármacos se pueden rediseñar para aplicaciones terapéuticas y de imágenes simplemente incluyendo el fármaco terapéutico y la fracción de imágenes en un nanoportador.
Esto tiene aplicaciones útiles tanto en el tratamiento del cáncer como en las enfermedades infecciosas. Demostrando el procedimiento estará Rasha Msallam, investigadora principal de mi laboratorio. Para empezar, dos horas antes de la inyección subconjuntival, inyecte al ratón por vía intravenosa a través de la cola con 2,5 miligramos por kilogramo de azul de Evans o EB. Después de sedar el ratón con 5% de isoflurano, transfiera el ratón a un cono nasal y mantenga el ratón sedado en una almohadilla térmica.
Luego, recorte los bigotes cerca del ojo para inyectarse. Instila una gota de solución de clorhidrato de proxymetacaína al 0,5% directamente en el ojo. A continuación, cargue una jeringa de vidrio de 10 microlitros equipada con una aguja de calibre 32 con liposomas fluorescentes y asegúrese de que las burbujas de aire no estén presentes en la jeringa.
Con una pinza, levante la conjuntiva e inyecte lentamente liposomas en el espacio subconjuntival, luego retire la aguja lentamente, evitando el flujo de regreso. Asegurar la formación de ampollas llenas de liposomas fluorescentes. Administre una gota de ácido fusítico al 1% en el ojo y controle al ratón hasta que recupere la conciencia.
Encienda el sistema CLM. Conecte la sonda al sistema CLM. Elija el campo de visión y la ubicación de los archivos de adquisición en este punto.
Ajuste la intensidad del láser para asegurarse de que la detección de fluorescencia para fluoresceína DHPE esté en el rango lineal y mantenga la intensidad consistente para la comparación entre imágenes tomadas en diferentes puntos de tiempo. Después de calentar el sistema durante 15 minutos, calibre el sistema de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando el kit de calibración que contiene las soluciones de limpieza, enjuague y fluoro-4 para cada láser. Brevemente, comience a calibrar sumergiendo la punta durante cinco segundos cada uno en el vial de limpieza y luego en el vial de enjuague.
Deje la punta en el aire para la grabación de fondo para normalizar los valores de fondo de las diferentes fibras de las sondas, asegurando la uniformidad de la imagen. Nuevamente, sumerja la punta durante cinco segundos en el vial de limpieza y luego en el vial de enjuague. A continuación, sumerja la punta en el vial que contiene fluoro-4 de 488 nanómetros durante cinco segundos para normalizar los valores de la señal.
Repita la inmersión de la punta durante cinco segundos en el vial de limpieza seguido del vial de enjuague. Mantenga la punta en el vial de enjuague hasta que desaparezca la señal de fluorescencia registrada en el paso anterior. Luego, transfiera la punta en el vial que contiene fluoro-4 de 660 nanómetros para normalizar los valores de señal de diferentes fibras en la sonda.
Después de la calibración, asegúrese de que el valor sea inferior a 100 para el fondo de la sonda. De lo contrario, realice una limpieza repetida de la sonda con un aplicador de punta de algodón. Encienda el controlador de temperatura animal con una almohadilla térmica conectada y ajuste la temperatura a 37 grados centígrados.
Después de cubrir la almohadilla térmica con una cortina quirúrgica, fije el cono nasal en la almohadilla térmica. Después de sedar el ratón con 5% de isoflurano en una cámara de inducción, transfiera el ratón al cono de la nariz y mantenga el ratón sedado en una almohadilla térmica. Luego, inscriba una gota de solución anestésica de clorhidrato de proxymetacaína al 0,5% en el ojo.
Para lavar la superficie ocular y evitar la cristalización del cristalino, mantenga los ojos lubricados dejando caer unas gotas de solución salina. Luego, gire y ajuste el ocular del microscopio para ver el ojo del mouse ergonómicamente en el enfoque directo a un aumento de 0.67 veces. Encienda el láser y coloque la sonda como un bolígrafo directamente sobre la región del ojo para obtener la imagen.
Luego, comience a registrar la adquisición para observar la fluorescencia en el ojo en la región de interés. Detenga la grabación cuando todas las regiones estén marcadas y etiquetadas de acuerdo con el mapa ocular para conocer la ubicación exacta de la sonda en el marco exacto. Los archivos de adquisición se guardarán automáticamente como archivos de vídeo en la ubicación previamente elegida.
Las imágenes de fluorescencia revelaron una clara diferenciación entre las regiones de la esclerótica y la córnea. La alta vascularización de la epiesclera y la conjuntiva hizo que la región de la esclerótica se tiñera de rojo con EB. La córnea, que carece de vasculatura, parecía negra. La fluorescencia contrastante del limbo y la esclerótica se observó en un estudio de siete días.
Los ratones de control inyectados con colorante de fluoresceína confirmaron la especificidad de la fluorescencia derivada de liposomas. Las intensidades de fluorescencia fueron altas en el primer y tercer día. La fluorescencia verde representó la reducción de liposomas en las regiones del limbo y la esclerótica a lo largo del tiempo.
Las diferencias en las señales de fluorescencia del día uno al día tres después de la inyección en las regiones del limbo temporal y del limbo superior no fueron significativas, lo que indica la preferencia de los liposomas neutros a la región del limbo, particularmente la periferia corneal. Para las regiones temporal y superior en el primer día posterior a la inyección, la fluorescencia en la esclerótica fue seis veces mayor que en el limbo. En el tercer y séptimo día, los liposomas se redujeron significativamente en la esclerótica en las regiones temporal y superior, atribuidos a los mecanismos de aclaramiento ocular.
La menor cantidad de fluorescencia se detectó en las regiones nasal e inferior, debido a la distancia desde el sitio de inyección. Es importante etiquetar los fotogramas de manchas de acuerdo con el mapa ocular antes de detener la grabación. Mantenga la intensidad del láser consistente y defina el valor de fondo máximo para una comparación adecuada entre diferentes experimentos.
Tras la identificación de las formulaciones de plomo, se pueden realizar estudios farmacocinéticos y de biodistribución exhaustivos en animales para estudiar la biodisponibilidad del fármaco y validar la eficacia terapéutica de sus formulaciones.
