Este protocolo facilita a triagem de novas formulações para entender melhor como as modificações afetam seus tempos de residência tecidual, o que é fundamental na concepção de um sistema de entrega de medicamentos ideal. Esta técnica não é invasiva e permite imagens em tempo real, o que reduz o uso excessivo de animais para amostragem. Os sistemas de entrega de medicamentos podem ser redesenhados para imagens e aplicações terapêuticas, simplesmente incluindo a droga terapêutica e a moiety de imagem em um nano-portador.
Isso tem aplicações úteis tanto no tratamento do câncer quanto da doença infecciosa. Demonstrando o procedimento será Rasha Msallam, pesquisadora sênior do meu laboratório. Para começar, duas horas antes da injeção subconjuntival, injete o mouse por via intravenosa via cauda com 2,5 miligramas por quilograma de azul Evans, ou EB. Depois de sedar o mouse com 5% de isoflurane, transfira o mouse para um cone de nariz e mantenha o rato sedado em uma almofada de aquecimento.
Em seguida, corte os bigodes perto do olho para serem injetados. Incutir uma queda de 0,5% de solução de cloridrato de proxymetacaína diretamente no olho. Em seguida, carregue uma seringa de vidro de 10 microliter equipada com uma agulha de calibre 32 com lipossomos fluorescentes e certifique-se de que as bolhas de ar não estejam presentes na seringa.
Usando uma pinça, levante a conjuntiva e injete lentamente lipossomos no espaço subconjuntivo, em seguida, retire a agulha lentamente, impedindo o fluxo de volta. Certifique-se da formação de bleb preenchido com lipossomos fluorescentes. Administre uma gota de ácido fusitic de 1% no olho e monitore o mouse até que ele recupere a consciência.
Ligue o sistema CLM. Conecte a sonda ao sistema CLM. Escolha o campo de exibição e o local para os arquivos de aquisição neste momento.
Ajuste a intensidade do laser para garantir que a detecção de fluorescência para fluoresceína DHPE esteja na faixa linear, e mantenha a intensidade consistente para comparação entre imagens tiradas em diferentes pontos de tempo. Depois que o sistema for aquecido por 15 minutos, calibrar o sistema de acordo com as instruções do fabricante usando o kit de calibração contendo as soluções de limpeza, lavagem e fluoro-4 para cada laser. Brevemente, comece a calibrar imergindo a ponta por cinco segundos cada um no frasco de limpeza e, em seguida, no frasco de lavagem.
Deixe a ponta no ar para gravação de fundo para normalizar os valores de fundo das sondas diferentes fibras, garantindo uniformidade de imagem. Novamente, mergulhe a ponta por cinco segundos no frasco de limpeza e, em seguida, no frasco de lavagem. Em seguida, mergulhe a ponta no frasco contendo fluoro-4 488-nanômetro por cinco segundos para normalizar os valores do sinal.
Repita a imersão da ponta por cinco segundos no frasco de limpeza seguido do frasco de lavagem. Mantenha a ponta no frasco de lavagem até que o sinal de fluorescência registrado na etapa anterior desapareça. Em seguida, transfira a ponta no frasco contendo fluoro-4 660 nanômetros para normalizar os valores do sinal de diferentes fibras da sonda.
Após a calibração, certifique-se de que o valor seja inferior a 100 para o fundo da sonda. Caso contrário, realize a limpeza repetida da sonda com um aplicador de ponta de algodão. Ligue o controlador de temperatura animal com uma almofada de aquecimento anexada e ajuste a temperatura para 37 graus Celsius.
Depois de cobrir a almofada de aquecimento com uma cortina cirúrgica, fixar o cone do nariz na almofada de aquecimento. Depois de sedar o rato usando 5% de isoflurane em uma câmara de indução, transfira o mouse para o cone do nariz e mantenha o mouse sedado em uma almofada de aquecimento. Em seguida, incutir uma gota de solução de hidrocloreto de hidrocloreto de hidrocloreto de proxymetacaína de 0,5% para o olho.
Para lavar a superfície ocular e evitar a cristalização da lente, mantenha os olhos lubrificados soltando algumas gotas salinas. Em seguida, gire e ajuste a ocular do microscópio para ver o olho do mouse ergonomicamente no foco direto em 0,67 vezes a ampliação. Ligue o laser e coloque a sonda como uma caneta diretamente na região dos olhos a ser imagen.
Em seguida, comece a registrar a aquisição para observar a fluorescência no olho na região de interesse. Pare a gravação quando todas as regiões estiverem sinalizadas e rotuladas de acordo com o mapa dos olhos para saber a localização exata da sonda no quadro exato. Os arquivos de aquisição serão salvos automaticamente como arquivos de vídeo no local escolhido anteriormente.
A imagem de fluorescência revelou diferenciação distinta entre as regiões de esclera e córnea. A alta vascularização da episclera e conjuntiva fez com que a região da esclera manchasse o vermelho com EB. A córnea, que não tem vasculatura, parecia negra. A fluorescência de contraste de limbus e esclera foi observada em sete dias de estudo.
Os camundongos de controle injetados por corante fluoresceína confirmaram a especificidade da fluorescência derivada de liposomos. As intensidades de fluorescência foram altas no primeiro e terceiro dias. A fluorescência verde proxiou a redução lipossosome nas regiões de limbus e esclera ao longo do tempo.
As diferenças nos sinais de fluorescência do dia pós-injeção, do dia 1º ao terceiro dia, nas regiões de limbus temporais e membros superiores, não foram significativas, indicando preferência de lipossomos neutros à região do limbus, particularmente na periferia da córnea. Para as regiões temporais e superiores no primeiro dia pós-injeção, a fluorescência na esclera foi seis vezes maior do que no limbus. No terceiro e sétimo dia, os lipossomos foram significativamente reduzidos na esclera nas regiões temporais e superiores, atribuídas aos mecanismos de liberação ocular.
A menor quantidade de fluorescência foi detectada nas regiões nasais e inferiores, devido à distância do local da injeção. É importante rotular as molduras de manchas de acordo com o mapa dos olhos antes que a gravação seja interrompida. Mantenha a intensidade do laser consistente e defina o valor máximo de fundo para comparação adequada em diferentes experimentos.
Após a identificação de formulações de chumbo, estudos farmacocinéticos abrangentes e biodistribuição em animais podem ser conduzidos para estudar a biodisponibilidade da droga e validar a eficácia terapêutica de suas formulações.
